王新胜，王琳琳，姜福全*

(1.天津市第一中心医院 泌尿外科，天津300192;2.吉林大学中日联谊医院)

膀胱癌是常见的泌尿系统恶性肿瘤，大多数患者为非肌层浸润性，其侵袭能力较强，手术是其主要治疗手段，但术后易复发且伴有向肌层浸润性发展可能[1,2]。因此，目前亟待探索膀胱肿瘤转移的分子机制及寻找有效的方法治疗膀胱肿瘤的方案，以期提高患者生存率及生活质量。TRIM44(Tripartite motif-44，三重基序蛋白-44) 是TRIM家族的一员[3]，已有研究发现TRIM44在多种肿瘤的过表达参与调节细胞增殖、调控细胞周期进展促进肿瘤发生，使肿瘤具有更强的侵袭迁移能力及促血管生成导致肿瘤的转移。血管拟态观察微血管密度是评估肿瘤生长、复发、转移、预后的指标，具有重要的临床实用价值[4]。本研究将利用脂质体转染si-TRIM44到膀胱癌T24和5637细胞中，探讨敲降TRIM44表达对于膀胱癌细胞的生长、转移、侵袭及血管生成的作用，为进一步研究TRIM44作为靶向治疗膀胱肿瘤的重要分子奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料MTT、细胞生长周期试剂盒(碧云天生物技术研究所)；细胞培养相关试剂；Transwell小室(Corning 公司)；Matrigel 基底膜(BD bioscience)；Lipofectamine 2000(Invitrogen 公司)；Western Blot相关试剂(碧云天生物技术研究所)；抗人TRIM44单克隆抗体(Santa公司)；

1.2细胞培养及转染T24、5637细胞培养于含有10% 胎牛血清及1%链霉素和青霉素的DMEM完全培养基，置于5%CO2、37℃培养箱中。构建si-TRIM44小干扰RNA，应用脂质体Lipofectamine 2000将构建的si-RNA分别转染至T24和5637细胞中。本研究分组：si-NC空白对照组，si-TRIM44实验组。

1.3MTT检测细胞增殖情况取生长状态较好，处于对数生长期的细胞，种植于96孔板中。待细胞生长至90%融合时，利用脂质体转染，于转染后72小时，每孔加入20 μl 10%MTT溶液，避光培养4小时，弃上清后加入100 μl DMSO，在避光的条件下充分振荡，利用酶标仪检测490 nm波长处的吸光光度值，重复3次，统计分析后观察细胞增殖情况。

1.4流式细胞仪检测细胞周期取6孔培养板中细胞，分别转染si-TRIM44及si-NC48h后，常规胰酶消化细胞，吹悬成单细胞悬液，1 000 rpm离心5分钟收集细胞，PBS冲洗细胞后加入75%乙醇，-20℃固定过夜。4℃ 1 000 rpm离心去除乙醇，加入500 μl PI染色液，37℃避光孵育30分钟，应用流式细胞仪检测，应用ModFit软件分析，测定并计算细胞周期中各期细胞的百分数。

1.5Transwell小室检测细胞侵袭及转移取24孔细胞培养板，每孔加入600 μl含20%FBS的DMEM培养液，将transwell小室置于其中，将细胞悬液200 μl(细胞浓度达到1×105/ml)加入上层小室，置于细胞培养箱内。24小时后取出小室，4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫溶液染色，每张膜随机选取5个视野，倒置显微镜下计数每个视野内的细胞数并拍照保存。Transwell侵袭实验采用将Transwell小室膜的上层均匀覆盖Matrigel基质胶，其余步骤同迁移实验。

1.6血管生成拟态(VM)的观察将300 μl预冷的Matrigel加入24孔细胞培养板，避免气泡产生，置于37℃培养箱30 min使其凝固。胰酶消化各组细胞，每孔内接种1 ml浓度为5×105/mL细胞悬液，5%CO2、37℃培养12小时。倒置显微镜下观察细胞形成的网状结构，取5个视野照相记录管状结构的完整程度和数量。

1.7统计分析统计学方法采用SPSS17.0进行t检验，数值用均值和标准差表示，P<0.05代表差异有统计学意义。

2 结果

2.1正常膀胱上皮细胞和膀胱癌细胞中TRIM44的表达检测

利用q-PCR和Western Blot 方法分别检测正常膀胱上皮细胞(SV-HUC-1)和膀胱癌细胞系(T24和5637)中TRIM44的表达情况，如图1所示，在mRNA和蛋白质水平，T24和5637细胞中TRIM44的表达水平明显高于SV-HUC-1细胞(*P<0.05)。

图1 细胞中TRIM44的表达情况

2.2TRIM44敲降后膀胱癌细胞的表达检测

应用q-PCR和Western Blot方法检测转染si-RNA及其对照si-NC后膀胱癌细胞系(T24和5637)中TRIM44的表达情况，如图2所示，在mRNA和蛋白质水平，可见转染si-TRIM44组细胞比转染si-NC组细胞中TRIM44 表达明显下调(**P<0.001)，表明转染si-TRIM44敲降效果的有效性。

图2 转染si-TRIM44后细胞中TRIM44的表达情况

2.3敲降TRIM44的表达可抑制膀胱癌细胞的增殖

利用MTT检测结果显示，si-TRIM44转染组与对照组相比，敲降TRIM44的表达使细胞增殖活性明显减慢，差异具有统计学意义(*P<0.05，见图3)，可见干扰TRIM44能够抑制膀胱癌细胞的生长。

2.4敲降TRIM44的表达阻滞膀胱癌细胞生长周期的进展

利用流式细胞仪检测细胞生长周期变化，si-TRIM44转染组与对照组相比，敲降TRIM44的表达使两组膀胱癌细胞均出现了明显的G0/G1期阻滞，S期细胞减少，差异具有统计学意义(*P<0.05，**P<0.001,见图4)。

图3 TRIM44对膀胱癌细胞增殖的作用

图4 TRIM44对膀胱癌细胞生长周期的作用

2.5敲降TRIM44的表达抑制膀胱癌细胞的迁移和侵袭

通过对比Transwell小室中加入或不加入Matrigel胶发现，si-TRIM44转染组细胞迁移和侵袭数量明显低于对照组(**P<0.001，见图5)，表明TRIM44可促进膀胱肿瘤的迁移和侵袭。

图5 TRIM44对膀胱癌细胞迁移、侵袭的作用

2.6敲降TRIM44的表达抑制血管生成

显微镜照相记录转染细胞组中血管拟态管状结构的排列情况，我们观察到对照组可见明显的拟血管状结构出现，而si-TRIM44组无明显血管形成，通过计数对比发现si-TRIM44转染组细胞拟血管成管能力明显低于对照组(*P<0.05，**P<0.001，见图6)。

图6 TRIM44对膀胱癌细胞血管生成拟态的作用

3 讨论

本研究中，我们利用基因转染使TRIM44在膀胱肿瘤细胞中低表达，研究发现TRIM44基因能促进膀胱肿瘤细胞生长，迁移及侵袭，促进血管的生成，TRIM44低表达抑制肿瘤的生长和转移。

以往研究证实，TRIM44具有保守的环指结构、B-BOX 结构以及超螺旋结构域[5]，在恶性肿瘤的发展过程中具有重要的调节作用。TRIM44 在胃癌[6]、前列腺癌[7]、乳腺癌[8]、睾丸肿瘤[9]等多种肿瘤中表现出过度表达状态，过度表达的TRIM44可促进肿瘤生长，促进肿瘤转移，其分子机制可能与激活mTOR、NF-κB信号通路有关[10,11]。沉默TRIM44基因的表达抑制Wnt/β-catenin 通路从而抑制甲状腺癌的发生[12]。TRIM44的高表达促进肿瘤发生过程中上皮间质转化的发生，其分子机制与AKT/mTOR通路的激活及下游STAT3的磷酸化活化有关[13]。本研究发现TRIM44基因在膀胱癌中能够促进细胞增殖，促进细胞周期进展，促进血管的形成，促进细胞的侵袭和迁移。肿瘤细胞增殖是恶性肿瘤的重要特征，本试验的研究结果发现,敲降TRIM44可明显降低肿瘤细胞的增殖。肿瘤细胞迁移能力增强促进肿瘤发生远处转移，通过Transwell小室细胞迁移实验我们得知si-TRIM44组迁移细胞的数量明显减少，加入Matrigel胶可模拟肿瘤侵袭状态，沉默TRIM44抑制了肿瘤的侵袭及转移能力。TRIM44在膀胱肿瘤中发挥着致癌基因的作用，沉默其表达可抑制膀胱肿瘤的增殖、侵袭及迁移能力。

在本研究中，我们的成果显示，特异性干扰TRIM44可以抑制膀胱肿瘤的生长及迁移，初步发现TRIM44可作为膀胱肿瘤基因治疗的候选基因，有利于阐明膀胱肿瘤的生长及转移的分子机制，为基因靶向治疗膀胱肿瘤的进一步研究奠定基础，同时也为膀胱肿瘤患者的个体化治疗提供了新线索。