刘东杰，纪 乐，刘 凯，陈德喜，吴 刚

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染可以导致慢性乙型肝炎、多种肝脏疾病以及肝癌的发生,抑制HBV生存周期的某些重要环节成为控制HBV感染的重要手段[1]。最近有报道称HBV可以利用细胞自噬来促进自身复制和存活[2-4]。p53凋亡刺激蛋白2(apoptosis stimulating protein 2 of p53,ASPP2)可以对自噬产生抑制作用[5]。本研究将检测过表达ASPP2对HepG2.215细胞的自噬,以及对乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)和乙型肝炎E抗原(hepatitis Be antigen,HBeAg)表达的影响,从而揭示ASPP2是否可以通过抑制自噬来达到抗HBV的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 HepG2.215细胞、人ASPP2重组腺病毒(ASPP2 recombinant adenovirus,rAd-ASPP2)、对照腺病毒(rAd-vector)和GFP-LC3质粒来自北京市肝病研究所陈德喜教授实验室。自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)购自美国SIGMA公司。DMEM培养基、胎牛血清和青链霉素购自美国Invitrogen 公司。 抗 LC3-Ⅰ/Ⅱ、Atg5、Atg14、Beclin-1、p62、β-actin和ASPP2抗体购自美国Abcam公司。HBeAg酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测试剂盒购自广州健仑生物科技有限公司；HBsAg ELISA检测试剂盒购自上海纪宁生物科技有限公司。蛋白裂解液试剂盒、蛋白定量试剂盒、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶制备试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司。聚偏二氟乙烯膜购自美国Bio-Rad公司。脱脂奶粉和RIPA裂解液购自北京普利莱基因技术有限公司。化学发光底物试剂盒购自美国Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和药物处理、腺病毒感染HepG2.215细胞用DMEM完全培养基(10%胎牛血清和1%青链霉素),在37℃,5%CO2孵箱中培养。3-MA用无菌去离子水配置。5 mmol/L的3-MA处理来抑制HepG2.215细胞的自噬,无菌去离子水为对照。rAd-ASPP2通过感染HepG2.215细胞来诱导ASPP2过表达,rAd-vector感染作为对照。

1.2.2 ELISA检测培养上清和细胞内HBsAg和HBeAg的水平 3-MA处理或rAd-ASPP2感染48 h后收集HepG2.215培养上清,细胞则用RIPA裂解液裂解,并将培养上清和细胞裂解液保存于-80℃。……