熊 鸣，张达矜，乔媛媛，史成和

体温过低症是一种严重的临床综合征,中重度体温过低症的死亡率极高,病死率甚至高于心肌梗死和感染性休克,但其救治困难的机制尚不十分清楚[1]。低温是体温过低症最根本的致伤因素。多项动物和细胞实验证实低温可直接诱导组织损伤和细胞死亡。已有研究提示,肠上皮细胞功能、结构受损在低温脏器损害的发生发展中可能具有极其重要的作用[2]。本研究拟在前期工作基础上,通过正交设计优化低温应激诱导大鼠小肠隐窝上皮(intestinal epithelial crypt,IEC-6)细胞损伤条件,建立较为稳定的低温应激细胞损伤实验模型,为后续的低温应激损伤与继发性损伤机制以及救治研究奠定细胞学实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料 大鼠IEC-6细胞株由中国医学科学院基础所细胞中心提供。高糖DMEM培养基和胎牛血清为美国Gibco公司产品；细胞增殖/毒性检测试剂(cell counting kit-8,CCK-8)为日本同仁化学研究所产品；细胞凋亡检测试剂AnnexinⅤ-PE/7-AAD Kit和线粒体膜电位检测试剂JC-1 Kit为美国BD公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 细胞接种于含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的高糖DMEM培养基,置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。每2～3天传代1次。

1.2.2 细胞低温处理方法 将生长良好的IEC-6细胞置于密闭细胞培养小室(billups-rothenberg产品,MIC-101型),设定通气条件为95%空气+5%CO2预混合气体,以20 L/min流量持续通气8 min,置于设定温度条件有机箱中。

1.2.3 正交实验设计 根据预实验结果,在50%＜细胞存活率＜90%范围内采用正交实验设计进一步优化处理条件。以温度、处理时间和接种……