葛敏敏,王建华,刘靖靖,王 颖,李 晓,汤志旭

(1.中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛 266001; 2.青岛海关检验检疫技术中心,山东青岛 266002; 3.山东省海洋生物研究院,山东青岛 266000)

南美白对虾(Penaeusvannamei),又称凡纳滨对虾,不仅蛋白质含量高，而且含有丰富的多不饱和脂肪酸及镁、钙、磷、碘等微量元素,营养价值非常高。但因其水分、蛋白质含量高,组织蛋白酶活性较强等特点,南美白对虾不易贮藏,易于腐败变质产生异味,影响其品质。

固相微萃取(solid phase microextraction,SPME)是20世纪90年代初由加拿大Watrloo大学Pawliszyn所在科研小组研发的无溶剂的样品前处理技术[1],集萃取、浓缩、解析为一体,是目前应用最广泛的海产品挥发性成分的提取方法。Mall[2]、蔺佳良[3]利用SPME技术，分别研究了不同加工方式下的的南美白对虾的挥发性风味物质,贠三月[4]研究了南美白对虾不同部位的挥发性风味物质,而朱亚珠[5]、郭美娟[6]利用SPME技术，分别研究了室温贮藏下毛虾虾皮、25 ℃贮藏条件下南美白对虾挥发性物质的变化。目前对虾的挥发性物质研究主要集中在风味物质的研究上,而对其贮藏过程中挥发性物质变化研究较少。对于挥发性物质定性,目前通常都要求GC-MS分析未知挥发性化合物时计算保留指数(retention index,RI),认为GC-MS结合RI及标准品的匹配法进行定量分析是可信度最高的方法[7]。

对于特征挥发性物质的筛选,Kuuliala[8]采用聚类分析、主成分分析、偏最小二乘回归分析(PLS)对不同气调包装(4 ℃ 贮藏)条件下褐虾和大西洋鳕鱼挥发性物质分析,找出多种腐败的潜在标记物质;主成分分析法是一种将多个指标化为少数互相无关的综合指标的统计学方法,在挥发性物质分析中得到广泛应用[9-10],朱丹实[11]利用挥发性物质与(total volatile base nitrogen,TVB-N)相关性分析得出多种新鲜度指示物。

本实验采用HS-SPME-GC-MS并结合RI定性的方法,分析4 ℃ 贮藏南美白对虾0～12 d挥发性物质变化情况,并且利用主成分分析和相关性分析方法进行挥发性物质的筛选。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

南美白对虾 山东东营养殖;正己烷(色谱纯)上海植茂环保科技有限公司;正庚烷(色谱纯)上海麦克林生化科技有限公司;C8～C36正构烷烃(色谱纯) 美国色谱科公司;三甲胺盐酸盐(98%) 上海麦克林生化科技有限公司。

带有Agilent PAL3自动进样系统的7890A-240气相色谱质谱联用仪 美国安捷伦公司;2300全自动凯氏定氮仪 瑞典福斯集团公司;50/30 μm二乙烯苯(DVB)/碳分子筛(CAR)/聚二甲基硅烷(PDMS)萃取头 美国色谱科公司。

1.2 实验方法

1.2.1 南美白对虾的贮藏和挥发性物质的萃取 南美白对虾虾解冻,沥干水分,放置于4 ℃冰箱中贮藏,每天测其挥发性物质(0～12 d)。将虾去除头部、尾部、虾壳,打碎称取2.00 g于顶空进样瓶中,50 ℃条件下,平衡5 min,萃取50 min;进样口解析5 min(250 ℃),用GC-MS进行分离鉴定。

1.2.2 挥发性物质的分离与检测 采用GC-MS对挥发性物质进行分离和检测。色谱条件:色谱柱为HP-5 毛细管柱(30 m×250 μm×0.25 μm);程序升温模式,初始40 ℃保持5 min,以5 ℃/min升至220 ℃,保持5 min;进样口温度250 ℃;He为载气,流速是0.8 mL/min,不分流模式进样。质谱条件:电离方式为EI,电离能量为70 eV;接口温度为280 ℃;离子阱温度为200 ℃;质量扫描范围为35～300 m/z。

1.2.3 挥发性物质的定性和定量 挥发性物质经NIST14谱库检索与保留指数定性,其中匹配率>800(完全匹配为1000),所有文献中的保留指数信息均在NIST14查得;以峰面积进行定量分析。

保留指数计算公式:IT=100Z+100[TR(x)-TR(z)]/[TR(z+1)-TR(z)]

1.3 circRNA的类别 理论上，circRNA可以产生于基因组的任何区域。一个circRNA通常由1～5个外显子和/或1～2个内含子组成，可能同时含有编码区或非编码区成分。根据组成不同可以将circRNA分为内含子环状RNA (intronic circRNA)、外显子环状RNA (exon circRNA)、外显子—内含子环状RNA (exon-intron circRNA)和基因间区环状RNA (intergenic circRNA)4个类别[5]。

式中,TR(z)、TR(z+1)代表正构烷烃的保留时间,TR(x)代表挥发性物质的保留时间,Z代表正构烷烃碳的个数,其中TR(z+1)>TR(x)>TR(z)。

1.2.4 TVB-N的测定 采用全自动凯氏定氮仪按照GB/T 5009.228-2016食品中挥发性盐基氮的测定[12]测定。

1.3 数据分析

聚类分析法:采用系统聚类的方法,以欧氏距离的平方为度量标准,通过组间连接的方式以66 种挥发性物质作为变量,对样品0～12 d 6个贮藏阶段的挥发性物质进行聚类分析。

主成分分析法:将数据标准化处理后,做因子分析,得到主成分的得分系数矩阵、方差贡献率、特征值及旋转成分矩阵,求不同挥发性物质的主成分综合评价得分(由主成分方差贡献率对主成分得分加权求平均值得到,记为F),并根据旋转成分矩阵做主成分分析载荷图。

利用Excel 2010、SPSS 19、Origin 9软件对南美白对虾贮藏过程中肌肉挥发性成分进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 南美白对虾4 ℃贮藏过程中的挥发性物质

南美白对虾4 ℃贮藏0～12 d的挥发性物质定性及定量变化见表1,共检出66种,其中包括醛类12种、醇类11种、酮类9种、酯类10种、酸类2种、烃类7种、含氮物质6种、含硫物质7种、其他2种。

表1 南美白对虾贮藏过程中肌肉的挥发性物质Table 1 Volatile components of Penaeus vannamei muscle during storage

续表

2.1.1 醛类、醇类、酮类物质 南美白对虾挥发性物质中的醛类、醇类、酮类物质的种类占挥发性物质的一半,这三类挥发性物质中的脂肪族类物质,主要来源于脂肪氧化。南美白对虾中多不饱和脂肪酸酶促氧化,生成的醛、酮、醇等化合物主要为C6、C8、C9化合物,其中,C6化合物呈青草味,C8化合物呈蘑菇或紫罗兰的气味,C9化合物呈类似黄瓜的香味,这些化合物是新鲜南美白对虾清香味的主要来源[13],南美白对虾中此类物质有2-乙基己醇、2-壬酮等物质;脂肪的非酶促氧化,产生的醛酮化合物,以适当浓度存在时可以赋予南美白对虾特殊的风味,但其含量过高就会使南美白对虾产生哈喇味,此类的挥发性物质有10-十一烯醛、癸醛、肉豆蔻醛、十五醛、十六醛、十八醛。非脂肪族物质苯甲醛、苯乙醛、苯乙醇可能来源于苯丙氨酸的Strecker降解的产物[14],其中苯乙醇为储藏后期(8～12 d)的特征挥发性物质。各种C6～C10醛类、醇类、酮类化合物可能是非微生物来源,而如2-甲基丁醛、3-甲基丁醛等分子量较小的则与微生物代谢有关[15],其含量的增加是南美白对虾贮藏过程中微生物代谢累积的结果。

2.1.2 酯类、烃类、含氮类、含硫类及其他类物质 酯类物质来源于脂肪酸和醇类物质的酯化反应,一般具有果香味,对腥味有一定的削减作用。酸类物质仅检出2种且含量不高,对整个贮藏过程中南美白对虾新鲜度变化影响不大。烃类主要是烷基自由基的脂质自氧化过程或类胡萝卜素分解产生,一般阈值较高,通常认为对产品整体风味贡献不大[16],因此烃类物质含量的变化对南美白对虾风味的变化影响不大。含氮物质中亚胺脲、三甲胺、吡嗪、吲哚变化程度较大,其含量大致呈上升趋势,其中亚胺脲可能来源于生物胺(胍基丁胺)的分解;三甲胺是由南美白对虾中的氧化三甲胺经兼性厌氧菌还原而产生的挥发性含氮物质,其含量的增加会使南美白对虾腥味加重;吡嗪类化合物赋予产品焦糊味和烤面包味,为美拉德反应产物[17],是南美白对虾贮藏后期的特征挥发性物质;吲哚具有腐败臭气,是由微生物降解蛋白质降解产生[18],其含量增加会使南美白对虾产生明显的臭味。含硫物质一般来源于含硫氨基酸的降解,一般具有刺激性气味,如二甲基三硫化物是鱼露特征香味。其他挥发性物质包括苯并噻唑,主要是还原糖在硫化氢和氨存在下,通过热降解得到的[17]。

挥发性物质还可能来源于环境污染物。有文献认为，海产品中的萘、苯类化合物是从饲料和环境中转移积蓄到鱼体中,在草鱼[19]、鳜鱼[20]等多种水产品中均有检出;二硫化碳、三溴甲烷水体污染物分别在中华鳖[21]、缢蛏稚贝[22]中有检出。

2.2 挥发性物质变化与新鲜度的相关性分析

2.2.1 挥发性物质的聚类分析 聚类分析结果见图1,当横坐标距离为9.5时,南美白对虾样品可分为贮藏0～4、5～8、9～10、11、12 d 5个集群,由此可见，通过对挥发性物质变化的聚类分析可区分不同新鲜度的南美对虾样品。

图1 不同贮藏时期南美白对虾肌肉样品的聚类分析图Fig.1 Dendrogram of Penaeus vannamei muscle samples at different storage periods

2.2.2 挥发性物质聚类与TVB-N的相关性 由图2可知,南美白对虾贮藏6 d后(包含第6 d)TVB-N含量超过国标30 mg/100 g,并且TVB-N(y)随时间(x)的变化与幂函数y=9.41e0.21x拟合,拟合度R2=096,说明TVB-N的变化率越来越大。

图2 贮藏南美白对虾的TVB-N变化Fig.2 Changes of TVB-N of Penaeus vannamei during storage

以TVB-N作为衡量南美白对虾的新鲜度的理化指标,南美白对虾聚类分析的第1个集群为贮藏0～4 d,代表没有腐败变质的南美白对虾;第2个集群为贮藏5～8 d南美白对虾,代表腐败的南美白对虾(除第5 d外都已腐败变质);第3、4、5个集群分别为贮藏9～10、11、12 d的南美白对虾,他们都代表严重腐败变质的南美白对虾。第3、4、5个集群样品特征值差异较大,说明这三个集群间挥发性物质差异较大,9～12 d挥发性物质的差异越来越大,这与TVB-N变化速率越来越大相一致,说明南美白对虾贮藏9～12 d相较于贮藏前期新鲜度变化速率加快。

总之,南美白对虾挥发性物质的变化不仅可以将不同新鲜度南美白对虾进行归类,而且可以表征南美白对虾新鲜度的变化速率。

2.3 特征挥发性物质筛选

2.3.1 根据挥发性物质与新鲜度(即TVB-N)的相关性进行特征挥发性物质筛选 仍以TVB-N作为衡量南美白对虾的新鲜度的变化的理化指标,将南美白对虾挥发性物质与TVB-N变化进行相关性分析,极显著相关(p<0.01)的挥发性物质有29种,见表1。这29种特征挥发性物质中包括16种贮藏过程中(除第0 d外)共有的挥发性物质和13种贮藏过程中出现的挥发性物质。其中共有的挥发性物质可作为南美白对虾新鲜度相关物质,其含量变化可以用来表征新鲜度的变化;贮藏过程中出现的挥发性物质可根据其在贮藏过程中出现的时间作为南美白对虾新鲜度节点物质,新鲜度相关物质和新鲜度节点物质种类如表2所示。

表2 南美白对虾肌肉特征挥发性物质Table 2 Characteristic volatile components of Penaeus vannamei muscle

2.3.2 以主成分分析进行特征挥发性物质筛选 主成分个数的选取要遵循既减少变量的个数又有利于对实际问题的分析和研究的原则,先按累积方差贡献率不低于某个阀值(比如85%)的原则确定前几个主成分,然后以每个主成分各自的贡献率为权数，将选定主成分线性加权求和来综合评价样本的优劣[23-24]。对4 ℃ 贮藏南美白对虾69种挥发性物质进行主成分分析,提取特征值>1的3个主成分(记为F1、F2、F3),如表3所示,3个主成分的总方差贡献率累积达到 89.72%,故选取F1、F2、F3这3个主成分。

表3 主成分方差贡献率Table 3 Variance contribution of principal components

由图3可以看出，南美白对虾贮藏0～7 d样品在第2、3主成分上载荷较大,贮藏8～12 d样品在第1主成分上载荷较大,说明贮藏第0～7 d样品与第2、3主成分高度正相关,贮藏8～12 d样品与第1主成分高度正相关。

图3 不同贮藏时间的南美白对虾肌肉 挥发性成分主成分分析载荷图Fig.3 PCA load diagram of volatile components in Penaeus vannamei’s muscle at different storage periods

各挥发性成分得分如表4所示(只分析主成分得分大于1的挥发性物质),吡嗪、2-乙基己醇、苯乙醇与第1主成分相关性最大,亚氨脲、2-乙基己醇、2-壬酮、苯乙酮、苯乙烯与第2主成分相关性最大,壬醛、辛醇、二烯丙基二硫与第3主成分相关性最大。由此可以说明，第1主成分代表的挥发性物质有吡嗪、2-乙基己醇、苯乙醇,第2主成分代表的挥发性物质有亚氨脲、2-乙基己醇、2-壬酮、苯乙酮、苯乙烯,第3主成分代表的挥发性物质有壬醛、辛醇、二烯丙基二硫。

表4 各挥发性物质主成分得分及排序Table 4 Evaluation results and rank of principal components for volatile components

续表

因此,南美白对虾贮藏0～7 d样品的特征挥发性物质为亚氨脲、2-乙基己醇、2-壬酮、苯乙酮、苯乙烯、壬醛、辛醇、二烯丙基二硫;贮藏8～12 d样品的特征挥发性物质为吡嗪、2-乙基己醇、苯乙醇。

主成分综合评价得分如表4所示,吡嗪、2-乙基己醇、亚氨脲对南美白对虾贮藏过程整体挥发性物质贡献较大,可作为南美白对虾4 ℃贮藏0～12 d整个过程的特征挥发性物质。

3 结论

本研究中共检出66种挥发性物质,而且大部分挥发性物质都经过过保留指数(RI)定性,并对其来源及变化规律进行分析。南美白对虾4 ℃贮藏条件下其挥发性物质种类和含量随之发生变化,通过对样品挥发性物质变化的聚类分析可将不同贮藏时间的样品聚类,且聚类情况也与南美白对虾新鲜度变化一致,说明挥发性物质可以用来表征南美白对虾新鲜度的变化;利用相关性分析和主成分分析两种方法进行特征挥发性物质的筛选,分别确定南美白对虾新鲜度相关物质、新鲜度节点物质和南美白对虾贮藏各个时间阶段及整个阶段的特征挥发性物质,为挥发性物质应用于南美白对虾新鲜度的检测提供理论基础。