于沛沛,王 斌,李婧茹,姜启兴,许艳顺,刘晓丽,杨 方,夏文水

(江南大学食品学院,江苏无锡 214122)

N-乙酰氨基葡萄糖(N-Acetyl-D-Glucosamine,NAG)作为葡萄糖的一种衍生物,在自然界中广泛存在,尤其在甲壳类动物的外骨骼中含量最高。它是合成双歧因子的重要前体,在生物体内具有许多重要生理功能,属于功能性氨糖类化合物,广泛应用于医药领域,食品配料以及化妆品等[1-2]。

苯甲酸是我国常用的食品防腐剂之一,在酸性条件下,对细菌和真菌都具有较强的抑制作用。因苯甲酸需要以分子的形式发挥抑菌作用,中性条件下，苯甲酸的羧基会发生电离,从而使其失去抑菌活性。苯甲酸不仅在中性条件下抑菌效果差,还存在叠加中毒现象,在使用上有争议,而且在一些国家的进口食品中受到限制,应用范围越来越窄[3-4]。N-乙酰氨基葡萄糖上有大量的羟基,如果把其作为多元醇,和具有抑菌活性的苯甲酸发生酯化反应,理论上既可以降低苯甲酸的毒性,又因苯甲酸基团的羧基生成酯键,在中性条件下不会发生电离,其抑菌效果可能受pH的影响不大。因此，开发苯甲酸酯化物对改善其中性条件下的抑菌效果，具有重要的现实意义。

本文通过酯化反应合成具有抑菌功能团的苯甲酸乙酰氨基葡萄糖衍生物,以期降低苯甲酸的毒性,扩大抑菌谱,弥补苯甲酸只在酸性条件下才有抑菌性的不足,使其可以在更宽的pH范围内使用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

N-乙酰氨基葡萄糖 南通双林生物制品有限公司;大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、黑曲霉(Aspergillusniger)、啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae) 江南大学食品学院微生物实验室;甲磺酸、苯甲酰氯、氨水、无水乙醚 分析纯,中国医药集团上海化学试剂公司。

SPX 型智能生化培养箱 南京实验仪器厂;ZK-82B型电热真空干燥箱 上海试验仪器有限公司;5DDXB FT-IR型红外光谱仪 美国 Nicolet公司;DF-101SA-H型集热式恒温加热磁力搅拌器 南京科尔仪器设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的合成及纯化 准确称取干燥至恒重的N-乙酰氨基葡萄糖2.21 g于250 mL三颈烧瓶中,加入15 mL甲磺酸,0 ℃下以900 r/min速度搅拌30 min,至N-乙酰氨基葡萄糖完全溶解。加入4.8 mL苯甲酰氯,继续搅拌3 h,反应结束后,产物于-18 ℃下静置2 h。将产物倾倒于500 mL冰水中,抽滤,得乳白色颗粒状固体。将滤饼置于500 mL去离子水中,磁力搅拌至产物均匀分散于水中,用1 mol/L的氨水调pH至7.0。抽滤,将滤饼用乙醚洗涤,至乙醚洗液中检测不出苯甲酸为止。抽滤,真空度90 KPa,温度70 ℃下，真空干燥得乳白色粉末状产物,即为苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯。

1.2.2 反应物配比对产物取代度的影响 在合成反应中,保持反应液温度0 ℃,反应时间3 h,将反应物(苯甲酰氯/N-乙酰氨基葡萄糖)摩尔比分别设为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1进行试验,通过高效液相分析,研究反应物摩尔比对产物各酯含量的影响。

1.2.3 合成产物的红外光谱分析 取反应温度0 ℃、时间3 h、反应物摩尔比4∶1下制得的苯甲酸壳聚糖酯样品100 μg,在4000～400 cm-1范围内记录其红外光谱图。

1.2.4 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的液相图谱分析 取苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯样品100 μg,进行高效液相检测。色谱柱为BEH C-18柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm),用0.2%的甲酸溶液和乙腈进行梯度洗脱,洗脱条件为:0 min甲酸/乙腈(100∶0,v/v),15 min甲酸/乙腈(50∶50,v/v),20 min甲酸/乙腈(0∶100,v/v)。流速0.3 mL/min,柱温30 ℃,采用WATERS ACQUITY PDA检测器,在波长280 nm处进行检测,进样量为5 μL[5-6]。

1.2.5 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的质谱分析 取苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯样品100 μg,采用质谱分析仪进行结构鉴定[6]。质谱条件:离子方式ESI-,毛细管电压3 kV,锥孔电压30 V,离子源温度100 ℃,脱溶剂气温度250 ℃,质量范围100～3000 m/z,光电倍增器电压1600 V,气体流速50 L/h。

1.2.6 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的物理性质测定

1.2.6.1 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯熔点的测定 取苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯样品1 mg,用毛细管法测定其熔点[7]。

1.2.6.2 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯溶解性的测定 准确称取经干燥至恒重的苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯样品1.0 g于50 mL烧杯中,室温下分别加入乙醇、乙醚、乙酸、丙酮、乙酸乙酯,搅拌使其充分溶解,过滤,沉淀经真空干燥(干燥温度30 ℃,干燥时间3 h,真空度90 KPa)后称重,样品在溶剂中的溶解度可由已溶解样品的百分量来确定[8]。

1.2.7 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯抑菌作用的影响因素

1.2.7.1 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯浓度对其抑菌作用的影响 选取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母、黑曲霉四种受试菌种,将苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯样品溶解在乙酸乙酯溶液中,使其浓度分别为0.5、1、1.5、2、2.5 mg/mL,在pH6.5时,用平板菌落计数法测定其抑菌率[9]。

1.2.7.2 pH对苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯抑菌作用的影响 选取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母、黑曲霉四种受试菌种,将苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯溶解在乙酸乙酯溶液中,浓度为1 mg/mL,分别在pH3.5、4.5、5.5、6.5和7.5时,用平板菌落计数法测定其抑菌率[9]。

1.2.8 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯对受试菌种抑菌直径的测定 选取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母、黑曲霉四种受试菌种,将苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯样品溶解在乙酸乙酯溶液中,浓度为1 mg/mL,分别在pH3.5、4.5、5.5、6.5和7.5时,用滤纸片抑菌圈法测定其抑菌效果,同时做苯甲酸和N-乙酰氨基葡萄糖的对照试验[10]。

1.2.9 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯对受试菌种最小抑菌浓度(MIC)的测定 选取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母、黑曲霉四种受试菌种,将不同浓度的苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯样品溶解在乙酸乙酯溶液中,在pH3.5、4.5、5.5、6.5和7.5时测定其MIC,同时做苯甲酸和N-乙酰氨基葡萄糖的对照试验[11]。

2 结果与分析

2.1 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的合成路线

将N-乙酰氨基葡萄糖与苯甲酰氯进行酯化,甲磺酸在反应中作催化剂,反应取决于N-乙酰氨基葡萄糖羟基对苯甲酰氯的亲核进攻[12]。由于位阻效应,与亚甲基相连的羟基反应活性更大,因此亲核进攻主要发生此位点,但N-乙酰氨基葡萄糖是椅式结构,其它羟基的位阻效应也不是很大,当反应物苯甲酰氯量小时,与亚甲基相连的羟基会优先发生反应,而苯甲酰氯过量的情况下,每个羟基都有可能发生酯化反应,其合成路线见图1。

图1 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的合成路线Fig.1 The synthetic route of benzoyl NAG ester

2.2 反应物配比对各酯含量的影响

从图2中可以看出,随着反应物配比的增加,产物的酯化度升高,出现了单酯、二酯、三酯、四酯等不同的酯化产物。单酯的最佳反应物配比为1∶1;二酯的最佳反应物配比为2∶1;三酯的最佳反应物配比为4∶1;四酯的最佳反应物配比为5∶1。N-乙酰氨基葡萄糖虽为小分子物质,且由于其椅式结构,空间位阻效应不大,但是要得到较高得率的四酯，仍然比较困难,从图中也可以看出,反应物配比从5∶1上升至10∶1时,四酯的含量基本不变。实验发现,单酯、二酯在水和大多数有机溶剂中都具有很好的溶解性,洗脱提纯时很容易损失掉,因此本文合成反应的主要产物为三酯。

图2 反应物配比对各酯含量的影响Fig.2 The effect of reactant ratio on the content of each ester

2.3 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的红外图谱

将纯化后的苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯进行红外光谱分析,结果见图3。图中1725 cm-1和1267 cm-1出现的强吸收峰,分别归属于C=O的吸收和C-O-C伸缩振动,表明有酯键生成,1400～1600 cm-1之间的吸收峰为苯环的伸缩振动所致,3400 cm-1处羟基的特征吸收峰几乎消失,表明有大量的羟基参与酯化反应[13]。

图3 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的红外图谱Fig.3 FTIR spectrum of benzoyl NAG ester

2.4 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的液质联用图谱

本研究采用HPLC法对苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯进行梯度洗脱,洗脱液由0 min 100%的甲酸溶液(0.2%)到20 min 100%的乙腈。图4为纯化后的苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的HPLC图谱,主峰保留时间为2.49 min,含量占89.95%,副峰保留时间为3.15 min,含量占6.35%。图5为纯化后的苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的MS图谱。负离子质谱图(ES-)中出现的534峰为[M+H],苯甲酸乙酰氨基葡萄糖三酯的分子量533与质谱信号相吻合,故可以认为2.49 min出峰的物质为苯甲酸乙酰氨基葡萄糖三酯;负离子质谱图(ES-)中出现的556峰为[M+Na],故可以认为3.15 min出峰的物质同为苯甲酸乙酰氨基葡萄糖三酯,为2.49 min出峰物质的同分异构体,两种三酯的总含量约为97%。由此可见,反应温度0 ℃,反应时间3 h,反应物(苯甲酰氯/N-乙酰氨基葡萄糖)摩尔比4∶1时，合成的产物主要为苯甲酸乙酰氨基葡萄糖三酯。

图4 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的液相图谱Fig.4 The HPLC of benzoyl NAG ester

2.5 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的物理性质分析

2.5.1 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的熔点 毛细管法测得N-乙酰氨基葡萄糖和苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的熔点。N-乙酰氨基葡萄糖的熔点为197～198 ℃,这与文献值相符[14],苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的熔程范围为171～175 ℃。苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的熔程变宽与样品的纯度有关,而熔点的下降与其分子结构有关。因为酯化反应后,酰基的接入破坏了N-乙酰氨基葡萄糖的排列规整性,从而导致其熔点下降。

2.5.2 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的溶解性 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯在不同有机溶剂中的溶解度见表1。从表1中可以看出,苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯除在乙醚中基本不溶外,在其它溶剂中的溶解度相差不大。苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯在乙酸乙酯中有较好的溶解性,在我国乙酸乙酯已被批准为食品添加剂[15],故可将产物先溶于乙酸乙酯,再添加至食品中。

表1 N-乙酰氨基葡萄糖、苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的溶解性(g/L)Table 1 Solubility of NAG and benzoyl NAG ester(g/L)

2.6 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯抑菌作用的影响因素

2.6.1 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯浓度对其抑菌作用的影响 抑菌剂浓度,即抑菌剂的添加量,是影响抑菌剂抑菌效果的一个重要因素。一般来说,添加量越高,其分子越多,与微生物接触的几率越大,抑菌效果就越好。但是当抑菌剂与微生物之间达到平衡时,再继续添加就不能增强抑菌效果了。浓度对苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯抑菌作用的影响见图6。从图中可以看出,苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的抑菌活性随浓度的升高逐渐增强,低浓度处出现的异常结果,可能是由于浓度差别太小，抑菌效果分辨不明显导致,并不能影响整体趋势[16]。

图6 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯浓度对其抑菌作用的影响Fig.6 The influence of inhibitory concentration on bacteriostatic action of benzoyl NAG ester

2.6.2 pH对苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯抑菌作用的影响 从图7可以看出,随pH由酸性到弱碱性的变化,苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的抑菌效果变化不大。pH变化也是影响抑菌剂抑菌效果的一个重要因素,许多抑菌剂必须在特定pH下才有较好的抑菌性,从而导致使用受限,因此是否具有较宽的pH使用范围已成为评价抑菌剂性能优劣的一个重要指标。由于苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯无自由氨基,主要靠苯甲酸基团发挥抑菌作用,而苯甲酸基团的羧基已生成酯键,在中性条件下不会发生电离,所以其抑菌效果基本不受pH影响。

图7 pH对苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯抑菌作用的影响Fig.7 The influence of pH value on bacteriostatic action of benzoyl NAG ester

2.7 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯对受试菌种的抑菌直径及MIC

表2和表3为苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯对四种受试菌种的抑菌效果,从抑菌直径的比较中可以看出,N-乙酰氨基葡萄糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌无抑制作用,而且在某些pH条件下还会作为糖分被啤酒酵母、黑曲霉所利用,出现促进生长的现象[17];苯甲酸对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果相似,pH≤4.5条件下，苯甲酸有较好的抑菌效果,但pH>4.5条件下，其抑菌活性迅速减弱,至pH6.5时失去抑菌活性,这是因为苯甲酸需要以分子的形式发挥抑菌作用,中性条件下苯甲酸的羧基会发生电离,从而使其失去抑菌活性[18];苯甲酸对啤酒酵母和黑曲霉表现出较好的抑菌效果,在pH3.5条件下，抑菌直径可达18 mm和17 mm,但pH≥6.5条件下，同对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的作用效果相似,几乎无抑菌性;合成产物苯甲酸乙酰氨基葡萄酯在所选pH范围内，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有较好的抑菌活性,在pH≥5.5条件下，抑菌效果优于苯甲酸,测定MIC值得到的结论和以上基本一致。

表2 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯对受试菌种的抑菌直径Table 2 The inhibition diameter of benzoyl NAG ester against strains

表3 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯对受试菌种的MIC值Table 3 The MIC of benzoyl NAG ester against strains

综上所述,与其母体N-乙酰氨基葡萄糖无抑菌性相比,合成产物苯甲酸乙酰氨基葡萄酯对受试菌种有良好的抑菌性;与苯甲酸相比,合成产物苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯亦弥补了苯甲酸只在酸性条件下具有抑菌性的不足,在酸性及中性条件下都有较好的抑菌效果。

3 结论

以N-乙酰氨基葡萄糖与苯甲酰氯为原料进行酯化反应,在反应温度0 ℃、反应时间3 h,苯甲酰氯/N-乙酰氨基葡萄糖摩尔比为4∶1时,经提纯得到合成产物主要为三酯。在pH3.5～7.5范围内对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母、黑曲霉的最低抑菌浓度(MIC)范围分别为2.4～2.6、1.4～1.6、2.0～2.2、1.8～2.0 g/L。与N-乙酰氨基葡萄糖相比,无论在酸性条件还是中性条件下,抑菌效果都明显优于N-乙酰氨基葡萄糖;与苯甲酸相比,在酸性条件下抑菌效果略低于苯甲酸,在中性条件下明显优于苯甲酸,苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯亦弥补了苯甲酸只在酸性条件下具有抑菌性的不足,在酸性及中性条件下都有较好的抑菌效果,有望作为一种安全、高效防腐剂广泛应用于酸性及中性食品中。