潘方方,李秀梅,张海英,马文建,*,杨培龙,*

(1.天津科技大学生物工程学院,天津 300457; 2.中国农业科学院饲料研究所,北京 100081)

长裂苦苣菜(SonchusbrachyotusDC.)系菊科苦苣菜属一年生草本植物,又名苦曲菜、苦菜、苦苣菜、苦荬菜、苣荬菜等,它的特征是根垂直直伸,生多数须根。茎直立,有纵条纹,基部直径达1.2 mm,上部有伞房状花序分枝,分枝长或短或极短,全部茎枝光滑无毛,其主要分布在黑龙江、吉林、内蒙古、河北、山西、陕西和山东等地,资源丰富,是一种价廉易得、药食两用的植物[1]。苦苣菜属植物的化学成分主要为萜类化合物(如倍半萜和三类)、黄酮类及黄酮苷。同时该属植物中还存在香豆素、木脂素、挥发油、糖类、生物碱、有机酸类、氨基酸类及微量元素等[2]。药理研究表明,长裂苦苣菜具有抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗心率失常、降压和降胆固醇、保肝、清除自由基等作用[3-7]。生物碱广泛存在于植物、动物、微生物等生物有机体内,其数量多、结构类型复杂多样,是最重要的天然产物之一[8]。现代药理学研究表明,天然植物中生物碱具有抗肿瘤、抗菌抗病毒、抗炎镇痛、抗氧化、抗纤维化等作用[9-11]。因此研究长裂苦苣菜中总生物碱具有重要意义。

近几年关于使用超声波法的报道比较多,许多人采用此法研究了不同原料中生物碱的提取,如曼陀罗种子、桑叶、铁苋菜等,这些研究极大地推动了生物碱提取工艺的发展[12]。但采用超声波法提取长裂苦苣菜中的生物碱的研究目前还少见报道。因此,本试验以长裂苦苣菜全草为材料,采用超声波法提取生物碱,通过单因素和响应面优化提取工艺条件,以期优选出长裂苦苣菜总生物碱的适宜提取工艺,为开发和利用生物碱资源提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乌头碱对照品 中国药品生物制品检定所;长裂苦苣菜 采自山东滨州,经中国农业科学院饲料研究所李秀梅助理研究员鉴定为SonchusbrachyotusDC.的全草;氢氧化钠、无水硫酸钠、邻苯二甲酸氢钾 西陇化工股份有限公司;溴麝香草酚蓝指示液 北京索莱宝科技有限公司;甲基红 上海金穗生物科技有限公司;氯仿和无水乙醇 北京化工厂;氨水和盐酸 北京北化精细化学品有限责任公司;以上试剂 均为分析纯。

SY-1000恒温超声提取机 北京弘祥隆生物技术股份有限公司;UV-3200紫外分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;ME-204电子天平 梅特勒-托利多仪器上海有限公司;FE-28 pH计 梅特勒-托利多仪器上海有限公司;YF114微型植物粉碎机 中国江阴市新友机械制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 乌头碱标准曲线的绘制 准确称取12.0 mg乌头碱标品置于试管中,加入1 mol/L盐酸溶液5 mL,溶解,加等量的1 mol/L氢氧化钠溶液,移至50 mL容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,摇匀,即可得浓度为0.24 mg/mL的乌头碱标品溶液。

准确量取乌头碱标品溶液0、0.35、0.40、0.50、0.80、1.00 mL,分别置于分液漏斗中,各加蒸馏水3.00、2.65、2.60、2.50、2.20、2.00 mL,加溴麝香草酚蓝指示液2.0 mL,邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钠(pH=6)缓冲液5.0 mL,氯仿10 mL,旋涡振荡3 min,室温静置1 h,分取氯仿液,并加入0.5 g无水硫酸钠,静置30 min,以只有蒸馏水的一份为空白,在410 nm处测其吸光值,以质量浓度(mg/mL)为横坐标,吸光值(A)为纵坐标绘制标准曲线[13],标准曲线为y=0.3119x-0.0526,R2=0.9997。

1.2.2 原料预处理方法 长裂苦苣菜清洗后于40 ℃烘箱烘至恒重,然后用微型植物粉碎机将长裂苦苣菜粉碎,过60目的分析筛于密封袋中保存,备用。

1.2.3 长裂苦苣菜总生物碱的提取 称取一定质量的长裂苦苣菜粗粉置于250 mL的锥形瓶中,以一定的料液比加入一定浓度的乙醇,在一定温度和功率下,调至合适的pH,进行一定时间的超声提取,静置10 min,将上层提取液倒入离心管中,5000 r/min 离心10 min,将离心后的提取液置于250 mL的锥形瓶中,使用相对应的乙醇浓度定容,备用。

取0.1 mL的提取液置于1 mL比色管中,用一定浓度的乙醇定容至刻度,以相对应的乙醇浓度为空白,并在410 nm处测定提取液吸光值,根据标准曲线测长裂苦苣菜中总生物碱的提取率,提取率(%)=(样品中总生物碱的重量/药材重量)×100。

1.2.4 单因素实验

1.2.4.1 料液比对长裂苦苣菜中总生物碱提取率的影响 采取1.2.3中方法提取长裂苦苣菜总生物碱,提取条件:在超声功率 500 W,超声温度50 ℃,超声时间30 min,pH为5和乙醇浓度为75%下,考察料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL)对总生物碱提取率的影响,进而确定最佳的料液比。

1.2.4.2 超声时间对长裂苦苣菜中总生物碱提取率的影响 采取1.2.3中方法提取长裂苦苣菜总生物碱,提取条件:在料液比为1∶30 g/mL,超声功率500 W,超声温度50 ℃,pH为5和乙醇浓度为75%下,考察超声时间(15、20、25、30、35 min)对总生物碱提取率的影响,进而确定最佳的超声时间。

1.2.4.3 超声温度对长裂苦苣菜中总生物碱提取率的影响 采取1.2.3中方法提取长裂苦苣菜总生物碱,提取条件:在料液比为1∶30 g/mL,超声时间为30 min,超声功率500 W,pH为5和乙醇浓度为75%下,考察超声温度(40、45、50、55、60 ℃)对总生物碱提取率的影响,进而确定最佳的超声温度。

1.2.4.4 超声功率对长裂苦苣菜中总生物碱提取率的影响 采取1.2.3中方法提取长裂苦苣菜总生物碱,提取条件:在料液比为1∶30 g/mL,超声时间为30 min,超声温度为55 ℃,pH为5和乙醇浓度为75%下,考察超声功率(400、500、600、700、800 W)对总生物碱提取率的影响,进而确定最佳的超声功率。

1.2.4.5 pH对长裂苦苣菜中总生物碱提取率的影响 采取1.2.3中方法提取长裂苦苣菜总生物碱,提取条件:在料液比为1∶30 g/mL,超声时间为30 min,超声温度为55 ℃,超声功率为700 W和乙醇浓度为75%下,考察 pH(3、4、5、6、7)对总生物碱提取率的影响,进而确定最佳的pH。

1.2.4.6 乙醇浓度对长裂苦苣菜中总生物碱提取率的影响 采取1.2.3中方法提取长裂苦苣菜总生物碱,提取条件:在料液比为1∶30 g/mL,超声时间为30 min,超声温度为55 ℃,超声功率为700 W和pH为5下,考察乙醇浓度(55%、60%、65%、70%、75%、80%)对总生物碱提取率的影响,进而确定最佳的乙醇浓度。

1.2.5 Box-Benhken中心组合实验设计 在单因素试验的基础上,利用响应面法对长裂苦苣菜中总生物碱的提取条件进行优化。根据Box-Benhken试验设计原理[14],选取对长裂苦苣菜中总生物碱提取率有显著影响的单因素液料比(A)、超声温度(B)、pH(C)和乙醇浓度(D)作为自变量设计响应面试验,考察提取总生物碱的最佳提取条件,因素水平见表1[15]。

表1 响应面试验因素水平设计表Table 1 Factors and their coded levels tested in response surface

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 料液比对总生物碱提取率的影响 由图1可知,随着溶剂量的不断增加,总生物碱的提取率呈现先逐渐增大后降低的趋势,提取率增加是因为溶剂与浸提物接触充分,使溶出率增加,当料液比达到1∶30 g/mL时,总生物碱的提取率达到最大(20.44%),但随着溶剂量继续增加,提取率反而呈下降趋势,这可能是当溶剂太多时,溶剂大量吸收超声波辐射而使其不能完全作用于长裂苦苣菜，从而影响总生物碱的提取率,故选择料液比为1∶30 g/mL。

图1 料液比对总生物碱提取率的影响Fig.1 Effect of the ration of solid to liquid on the extraction ratio of total alkaloids

2.1.2 超声时间对总生物碱提取的影响 由图2可知,超声时间小于30 min时,总生物碱提取率随着超声时间的增加,逐渐提高,但增加幅度不大。超声时间为30 min时,提取率达到最大值(19.85%),当时间超出30 min后,总生物碱提取率反而降低。可能是因为超声时间过长,部分不太稳定的生物碱发生了降解[16]。故提取过程中使用30 min即可。

图2 超声时间对总生物碱提取率的影响Fig.2 Effect of the ration of ultrasonic time on the extraction ratio of total alkaloids

2.1.3 超声温度对总生物碱提取的影响 由图3可知,当超声温度在40～55 ℃时,总生物碱提取率随着温度的升高而增加;超过55 ℃时,总生物碱提取率反而有所降低。这是因为温度过高,使生物碱的溶出量减少;也可能由于过高的温度使生物碱结构发生改变,同时杂质的浸出量也增加,从而影响了提取效果[16-17],故选择 55 ℃为较适宜的超声温度。

图3 超声温度对总生物碱提取率的影响Fig.3 Effect of the ration of ultrasonic temperature on the extraction ratio of total alkaloids

2.1.4 超声功率对总生物碱提取的影响 由图4可知,当超声功率小于700 W时,随着超声功率的增加,总生物碱的提取率也随之增加,当超声功率达到700 W时,总生物碱提取率达到最大值(20.34%),然而超过700 W后,总生物碱的提取率有所下降。这是因为对于一定频率和一定发生面的超声波来说,功率增大,声强随着增大,这就导致单位时间内超声产生的空化效应增强,从而有利于提高总生物碱的提取率。但是太高的声强会产生大量空化泡,通过反射声波可能减少能量的传递,并且空化泡与声强的增加呈非线性关系,这样可能会破坏生物碱的结构,从而影响总生物碱的提取率。故提取过程中使用700 W即可。

图4 超声功率对总生物碱提取率的影响Fig.4 Effect of the ration of ultrasonic power on the extraction ratio of total alkaloids

2.1.5 pH对总生物碱提取的影响 由图5可知,随着pH的增加,总生物碱提取率呈上升趋势,当 pH为5时,总生物碱提取率达到最大(20.21%),随着pH的继续增加,总生物碱提取率反而呈下降趋势,故选取5为适宜的pH。

图5 pH对总生物碱提取率的影响Fig.5 Effect of the ration of pH on the extraction ratio of total alkaloids

2.1.6 乙醇浓度对总生物碱提取的影响 由图6可知,在乙醇浓度为75% 时,总生物碱提取率最高(19.76%),随着乙醇浓度的继续增大,总生物碱提取率反而有所降低。其原因是随着乙醇的浓度增大,溶解在有机溶剂中的生物碱量会随之增多,但当乙醇浓度超过一定值时,长裂苦苣菜中的其他物质也会被提取出来,这反而会降低总生物碱的提取率。因此选取总生物碱提取的乙醇浓度为75%。

图6 乙醇浓度对总生物碱提取率的影响Fig.6 Effect of the ration of volume percentage of ethanol on the extraction ratio of total alkaloids

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面试验设计及结果 根据单因素实验结果,由Design-Expert 8.05b统计分析软件设计出的实验方案及实验结果如表2所示,建立四因素三水平中心组合实验设计，共包括29个实验方案,其中24个析因试验点,5个中心试验点,用以计算实验误差。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.2 回归方程拟合及方差分析 采用Design-Expert 8.05b统计软件对所得数据进行回归分析,回归分析结果如表3所示,对各因素拟合后,得到回归方程:Y=20.18-0.53A-0.068B+0.14C+0.47D-0.023AB-0.21AC-0.20AD-5.000×10-3BC-7.500×10-3BD-0.11CD-1.58A2-0.30B2-0.37C2-1.12D2

由表3可知,二项式拟合模型方程失拟项不显著(p>0.05),回归模型达到极显著水平(p<0.01),说明该模型与实测值拟合较好,回归模型R2=0.9902>0.9,表明该模型相关度好,可利用该模型分析最佳提取工艺条件。结果表明,液料比(A)、pH(C)、乙醇浓度(D)、液料比二次项(A2)、超声温度二次项(B2)、pH二次项(C2)、乙醇浓度二次项(D2)对响应值影响极显著(p<0.01),液料比与pH交互项(AC)、液料比与乙醇浓度交互项(AD)对响应值影响显著(p<0.05),各因素对响应值的影响顺序为A>D>C>B。

表3 回归统计分析表Table 3 Variance analysis for each term of the fitted regression equation

2.2.3 响应面及等高线分析结果 为了考察交互项对总生物碱提取率的影响,在两个因素固定不变的情况下,对模型进行降维分析,经Design-Expert 8.0.5b软件处理得到响应面及等高线见图7,图7a表明液料比和超声温度的交互作用对长裂苦苣菜生物碱提取率的影响不大。液料比过大导致了长裂苦苣菜生物碱的提取率下降,主要是由于长裂苦苣菜生物碱类化合物的相对极性影响的,料液比过大不能将一些极性较大的生物碱类物质溶解出来,另外温度过高,可能会使生物碱类化合物降解。图7b表明液料比与pH的交互作用对长裂苦苣菜生物碱提取率的影响显著。图7c表明液料比与乙醇浓度的交互作用对长裂苦苣菜生物碱提取率的影响显著。乙醇浓度在一定范围内可以使生物碱类化合物快速溶解,以便提高生物碱提取率。图7d表明超声温度与pH的交互作用对长裂苦苣菜生物碱提取率的影响不大。长裂苦苣菜生物碱提取率会随着超声温度和pH的增加而增加,当达到一定值时,长裂苦苣菜生物碱提取率就会下降或者变化不大。图7e表明超声温度与乙醇浓度的交互作用对长裂苦苣菜生物碱提取率的影响不大。长裂苦苣菜生物碱提取率会随着超声温度与乙醇浓度的增加而提高,当达到一定值时,提取效果不太明显。图7f表明pH与乙醇浓度的交互作用对长裂苦苣菜生物碱提取率的影响不大。长裂苦苣菜生物碱提取率会随着乙醇浓度和pH的增加而增加,当达到一定值时,长裂苦苣菜生物碱提取率就会下降或者变化不大。

图7 各两因素交互作用对总生物碱提取率影响的响应面及等高线图Fig.7 Three-dimensional response surface and contour plots showing interactive effects of hydrolysis conditions on total alkaloids

根据所得模型经响应面回归分析,得出最佳提取条件为:料液比1∶28.06 g/mL,超声温度54.43 ℃,pH5.21,乙醇浓度76.08%,在此条件下总生物碱提取率可达到20.30%。根据实际条件,调整的优化条件为:料液比1∶30 g/mL,超声时间30 min,超声温度55 ℃,超声功率700 W,pH为5,乙醇浓度75%。

2.2.4 验证实验 取3等份长裂苦苣菜粗粉进行平行验证实验,验证实验中3组实验的总生物碱提取率分别为19.93%,19.84%,20.32%,此3组实验的总生物碱提取率的平均值为20.03%,与预测值相比,可得出相对误差为1.35%。结果表明,经过响应回归方程拟合出的理论值与实际值相吻合,证明用响应面法可以有效地优化长裂苦苣菜提取总生物碱的工艺。

3 结论

本实验通过对影响长裂苦苣菜总生物碱提取的六个单因素:料液比、超声时间、超声温度、超声功率、pH、乙醇浓度进行了考察,利用Box-Behnken设计筛选出的四个主要影响因子:料液比、超声温度、pH、乙醇浓度。然后通过响应面分析法对各因素的最佳水平范围及其交互作用进行了研究和探讨,确定出最佳长裂苦苣菜提取总生物碱的条件为料液比1∶30 g/mL,超声时间30 min,超声温度55 ℃,超声功率700 W,pH为5,乙醇浓度75%,此条件下总生物碱提取率可达到20.30%。本实验采用Box-Behnken响应面法首次对长裂苦苣菜中总生物碱的提取工艺进行了优化,为其进一步开发提供了科学、合理的理论和实验依据。