刘相岑,郝晓蔚,张瑞婕,冯雯雯,朱晨光,*,张保国,*,史吉平

(1.上海大学生命科学学院,上海 200444;2.中国科学院上海高等研究院,上海 201210;3.河北科技大学,河北石家庄 050018)

甾体药物作为除抗生素外的第二大类药物,广泛应用于消炎、抗菌、抗肿瘤等领域[1]。雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)和雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)作为植物甾醇的代谢产物，是生产甾体药物不可或缺的关键中间体,几乎所有的激素类药物都可以其为原料进行生产[2]。传统工业多以化学方法合成甾体药物,但化学合成法存在工业污染严重，且目标产物收率低、成本高等问题,严重限制了甾体激素在药学领域的发展[3]。目前发现多种微生物如分枝杆菌、诺卡氏菌等，能通过体内相应的酶系高效降解甾醇，得到多种甾药中间体如9-OH-AD、AD、ADD等;以这些甾药中间体为前体，合成其他高价值甾体药物的方法具有产率高、污染小、生产成本低等优点。因此,采用微生物转化法降解植物甾醇获得ADD等甾体药物的重要中间体，成为甾体激素类行业中的一个研究热点[4-5]。

3-甾酮-Δ1脱氢酶(KstD)是植物甾醇生物转化过程中关键酶[6],是一种催化3-酮类固醇1,2-去饱和的诱导型黄素酶,能催化AD的A环C1,2脱氢形成双键而制得ADD[7],可极大地增加药物的生物活性和经济价值。例如可的松和皮质醇的1-脱氢衍生物较其本身可表现出更强的抗过敏和抗风湿活性,且副作用显著降低[8]。KstD不仅能够催化AD转化成ADD,而且对微生物甾醇代谢和其他甾药合成也起着重要的作用[9-10]。目前大多数研究都是通过在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等菌体内过表达KstD基因构建KstD过表达菌[11-15],然后以价格昂贵的AD为底物进行发酵脱氢而得到ADD,这种通过AD脱氢生产ADD的方法底物投料量低,生产成本相对增加[16-18],无法满足工业应用。

因此,为提高ADD生产水平,本研究通过在一株产AD的基因突变菌Mycobacteriumsp. ZFZ体内过表达KstD基因构建一株3-甾酮-Δ1脱氢酶过表达菌直接降解植物甾醇一步生成ADD;通过单因素和响应面实验，分析优化发酵培养基，来提高其生产ADD的能力,以期实现ADD生产工艺的优化和产率的提升。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大肠杆菌EscherichiacoliDH5α、分枝杆菌(Mycobacterium.DSM1381,Mycobacteriumsp. ZFZ)、分枝杆菌整合表达质粒pMV306 本实验室-80 ℃保藏;Prime STAR HS、限制性内切酶及in-fusion连接酶 TaKaRa公司;基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒 康宁生命科学有限公司;卡那霉素 上海麦克林生化科技有限公司;植物甾醇 江苏越红饲料有限公司;玉米浆 上海源肽生物技术有限公司;牛肉膏、酵母粉、葡萄糖、甘油、蛋白胨 上海生工生物工程有限公司;K2HPO4、NaNO3、甲醇、乙酸乙酯等 分析纯,国药集团(上海)化学试剂有限公司。

LC-20AD型高效液相色谱仪 日本岛津公司;GC-2010Plus气相色谱仪 日本岛津公司;BSA 224S-CW型电子天平 德国Sartorius;BX51 型显微镜 日本OLYMPUS;ZHWY-2102C型恒温培养振荡器 上海智城分析仪器制造有限公司;Centrifuge5430 低温离心机 德国Eppendorf公司;Molecular Imager® Gel DocTMXR System 生物技术公司;天能EPS 300型电泳仪 上海天能科技有限公司;HWS-12型数显恒温水浴锅 上海一恒公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基及母液配制 大肠杆菌LB培养基:蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,氯化钠10 g/L,pH7.0,121 ℃,灭菌20 min;种子培养基:酵母粉15 g/L,葡萄糖6 g/L,硝酸钠5.4 g/L,磷酸氢二铵0.6 g/L,吐温-80 2 g/L,pH7.5,115 ℃,灭菌15 min;初始发酵培养基:葡萄糖10 g/L,蛋白胨 10 g/L,K2HPO43 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,吐温80 2 g/L,植物甾醇10 g/L,pH7.5,115 ℃,灭菌15 min;植物甾醇乳化母液:称取24 g植物甾醇,加入1 g吐温80,用去离子水定容至400 mL，配成60 g/L的浓度,搅拌20 min,超声溶解60 min,121 ℃灭菌1 h备用。

1.2.2 过表达质粒pMV306-Psmyc-kstd的构建 分枝杆菌1381基因组DNA的收集参照基因组提取试剂盒的方法。以引物Psmyc-F/R(gatctttaaatctaga GGATCGTCGGCACCGTCA/gct tgatatcgaattc GGATCG TGCTCATTTCGGG)扩增启动子Psmyc，并利用in-fusion同源重组的方法，将其连接到质粒pMV306的XbaI和EcoRI位点之间，构建pMV306-Psmyc质粒;然后根据GENBANK公布的MycobacteriumATCC 25795基因组上的Kstd1序列为模板，设计扩增引物KstD-F/R(tatgggatccgaattcGTGTTCTACATGACTGC CCAGGA/tagttaactacgtcgac TCAGGCCTTTCCAGCGAGA)扩增MycobacteriumneoauriumDSM1381基因组上的kstd基因,并将其重组到pMV306-Psmyc质粒的EcoRI和SalI位点之间,构建KstD的过表达质粒pMV306-Psmyc-kstd。

1.2.3 分枝杆菌电转与筛选 将构建好的过表达质粒pMV306-Psmyc-kstd电击转入分枝杆菌感受态,在50 μg/mL的卡那霉素抗性平板上挑取单克隆,继续进行PCR验证，得到阳性转化子。

1.2.4 微生物培养及甾体转化条件 将构建的过表达菌和野生菌株于平板培养基活化,30 ℃恒温培养3 d后，挑取单克隆接种于种子培养基中,30 ℃,160 r/min培养至对数后期(OD600=6),获得液体种子。发酵培养基中接入10%体积的液体菌种，并补加灭菌后的葡萄糖溶液至5 g/L;放置30 ℃,160 r/min振荡培养箱培养至96 h时，取样进行HPLC和GC检测产物及底物浓度。

1.2.5 检测方法 对于具有共轭结构的甾体化合物AD和ADD及其他甾体中间产物可以利用高效液相色谱检测其在UV254 nm下的吸收值,通过比对标准品建立的标准曲线,可以测定产物的相对含量。

高效液相色谱(HPLC)检测条件:采用C18反相层析柱(Agilent SDB-C18,4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相为70%甲醇:30%水(V/V),流速为1.0 mL/min;柱温为40 ℃;紫外检测波长为254 nm;进样体积为20μL。而对于在紫外光下无吸收的植物甾醇，则通过气相色谱检测甾醇化合物的含量,具体参考柳相鹤等[19]的方法。

1.2.6 培养基优化方法

1.2.6.1 氮源单因素实验 根据预实验选择的玉米浆作为有机氮源,以ADD产量为指标,设置其浓度梯度为5、10、15、20、25、30、35、40(g/L),其他条件不变(本研究优化过程中由于MgSO4·7H2O对菌株发酵影响较小,因此浓度固定为0.5 g/L暂不做优化处理,下同)进行实验,选出获得ADD最大浓度的玉米浆浓度。随后在此玉米浆浓度的基础上，继续添加无机碳源硝酸钠,设置其浓度梯度为0、3、6、9、12、15 (g/L)分别进行实验,每组实验重复3次。

1.2.6.2 碳源单因素实验 根据预实验选择的葡萄糖作为碳源,以ADD产量为指标,设置浓度梯度为1、5、9、13、17、21 (g/L)进行实验,选择适宜的碳源浓度(其他条件不变),每组实验重复3次。

1.2.6.3 磷酸盐单因素实验 根据预实验选择的磷酸氢二钾作为磷酸源,以ADD产量为指标,设置浓度梯度为0.5、2.0、3.5、5.0、6.5、8.0 (g/L)进行实验,选择适宜的磷酸盐源浓度(其他条件不变),每组实验重复3次。

1.2.6.4 响应面试验设计 根据单因素实验结果,选用玉米浆、硝酸钠、葡萄糖和磷酸盐磷酸氢二钾的浓度为考察因素,以ADD产量为指标,采用Design-Expert8.0.6软件设计4因素3水平实验响应面试验,试验因子和编码水平如表1所示。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors and levels for response surface methodology

1.3 数据处理

本实验通过Design-Expert8.0.6软件，进行响应面实验设计及数据分析，并对最优结果进行预测验证,采用Origin Pro2017软件进行数据处理。用q检验法进行多重比较,标有不同小写字母表示组间差异显著(p<0.05),标有相同小写字母者表示组间差异不显著(p>0.05)。

2 结果与分析

2.1 重组质粒的构建与过表达菌株筛选

过表达质粒构建方法如图1所示,以引物Psmyc-F/R、KstD-F/R对pMV306和pMV306-Psmyc-KstD进行PCR验证(如图2所示),并送上海金维智测序公司测序防止基因点突变。

图1 过表达质粒pMV306-Psmyc-Kstd的构建策略Fig.1 Construction schematic of over-expression plasmid pMV306-Psmyc-Kstd

在对阳性转化子筛选验证时发现，阴性对照和转化子均有kstd条带(见图2),原因是出发菌株Mycobacteriumsp. ZFZ是一株主要产物为AD的基因突变菌,可能菌株本身基因组上脱氢酶仅关键活性位点发生了突变，导致其丧失了脱氢能力,所以基因组中也有相应大小的条带(图2泳道4);而转化子PCR产物验证条带(图2泳道5)相比出发菌株条带较大,由于模板增加，导致相同时间PCR扩增后的产物浓度比初始菌多一倍，说明转化子菌株基因组已经导入了外源KstD基因,而转化子是否具有脱氢效果则需进行甾醇转化进一步验证。

图2 过表达质粒的电泳图Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR products注:M:DNA Marker;1:Psmyc启动子验证条带;2:Kstd基因验证条带;3:质粒pMV306-Psmyc-KstD酶切验证;4:出发菌株ZFZ对照;5:重组菌ZFZ321验证。

2.2 过表达菌株的生长状况

KstD过表达菌株Mycobacteriumsp.ZFZ321与初始菌ZFZ的生长情况如图3所示,可以看出转入3-甾酮-Δ1脱氢酶的ZFZ321菌株在迟缓期和对数期都要比无3-甾酮-Δ1脱氢酶活性的初始菌株ZFZ的生长状况要好,可能是因为，3-甾酮-Δ1脱氢酶除了具有C1,2脱氢效果，还对分枝杆菌的生长具有一定的调节作用。

图3 Mycobacterium sp. ZFZ和ZFZ21的生长曲线Fig.3 Growth curve of Mycobacterium sp. ZFZ and ZFZ321

2.3 过表达菌株的甾醇转化

Mycobacteriumsp. ZFZ and ZFZ321对植物甾醇的转化结果如图4所示,ZFZ菌株发酵液中仍有部分ADD积累,说明此出发分枝杆菌本身发生突变的脱氢酶仍有相对较低的脱氢效果，或菌株可能还有具有其他脱氢活性较低的酶存在，故积累量极少，仅有0.21 g/L左右,而过表达菌株ZFZ321的发酵液中，随着时间的延长,ADD浓度逐渐增加值1.2 g/L左右,相比初始菌ZFZ产量提高了近5倍,说明Mycobacterium.DSM1381基因组中的KstD脱氢酶对于AD脱氢具有明显效果。

图4 ZFZ和ZFZ321对植物甾醇的生物转化Fig.4 Bioconversion of phytosterols by ZFZ and ZFZ321

2.4 单因素实验

2.4.1 氮源的选择 作为分枝杆菌生长需求量非常大的组成元素,合适的氮源水平对于微生物生物量的积累和甾醇降解具有非常重要的影响。当发酵培养基中有过高的氮源水平时,菌体有充分的营养物质维持自身的生长代谢，会降低对底物甾醇的利用;而氮源水平不足时,也会影响微生物对底物的利用。

随着玉米浆浓度增加(图5),ADD产量也逐渐增加;在玉米浆浓度达25 g/L时,ADD产量达到最高3.57 g/L;玉米浆浓度超过25 g/L时,发酵液中ADD积累量逐渐降低,这可能是由于，营养物质过剩导致菌株降解植物甾醇不充分。因此,选择25 g/L的玉米浆进行后续实验。

图5 玉米浆浓度对ADD产量的影响Fig.5 Effect of corn steep liquor concentration on ADD yield

图6为在玉米浆25 g/L浓度下,筛选无机氮源硝酸钠浓度对ADD产量的影响结果。由于是在玉米浆存在的基础上，筛选合适的硝酸钠浓度,发酵过程中已经存在较多的氮源,因此在0～15 g/L的区间筛选硝酸钠浓度水平。由图6可知，在硝酸钠浓度为3 g/L时,ADD产量达到最高,为3.69 g/L,随着硝酸钠浓度的进一步增加,ADD的积累量逐渐降低,原因可能是，少量的Na+可以促进微生物的代谢并且增加KstD的活性,从而使ADD的产量提高;而高浓度的Na+环境中,Na+和微生物体内的阴离子结合会对微生物产生毒害作用，从而抑制了微生物的代谢。

图6 硝酸钠浓度对ADD产量的影响(玉米浆25 g/L)Fig.6 Effect of sodium nitrate concentration on ADD yield(corn steep liquor concentration 25 g/L)

综上所述,在玉米浆作为主要氮源条件下,少量的硝酸钠会促进重组菌ZFZ321降解植物甾醇生产ADD;因此选择玉米浆25 g/L和硝酸钠3 g/L作为氮源进行后续研究。

2.4.2 碳源的选择 碳源作为微生物培养基的基本成分,能够为菌体的生长代谢提供能量及菌体细胞组成原料、噬菌体生长的必需能源物质,合适的碳源有利于促进某些酶的合成,增强分枝杆菌对甾醇的降解活性。

图7展示了葡萄糖浓度对菌株ZFZ321转化甾醇的影响。如图7所示,葡萄糖浓度对菌株生产ADD浓度有显著性影响(p<0.05)。随着葡萄糖浓度升高,ADD积累量也随之增加,葡萄糖浓度为9 g/L时,发酵液中ADD浓度达到最大值(3.82 g/L);当葡萄糖浓度继续增加时,ADD产量随之降低,原因可能是，低浓度的葡萄糖影响了菌体的生长状态而导致转化效率不高,而过高浓度的葡萄糖导致菌体摄取过多的糖用于生长代谢，而减少了对甾醇的摄取,使得ADD积累量降低。因此,后续实验选择9 g/L的葡萄糖作为碳源进行后续研究。

图7 不同葡萄糖浓度对ADD产量的影响Fig.7 Effect of glucose concentration on ADD yield

2.4.3 磷酸盐的选择 磷元素作为生物体核酸蛋白等的主要成分,影响菌体的能荷状态,且磷酸盐作为缓冲盐,对于发酵培养pH的稳定有重要作用。图8显示了磷酸氢二钾浓度梯度对重组菌ZFZ321积累ADD的影响。在磷酸氢二钾浓度为2 g/L的发酵液中，ADD的积累量达4.21 g/L,当浓度继续增加时,ADD的积累量逐渐降低。

图8 不同磷酸盐浓度对ADD产量的影响Fig.8 Effect of phosphate source concentration on ADD

2.5 响应面试验优化结果

2.5.1 模型的建立及显著性检验 利用软件Design-Expert 8.0.6对表2结果进行分析,方差分析结果如表3所示。对实验结果进行多元回归拟合,得到Mycobacteriumsp.ZFZ321发酵植物甾醇产ADD浓度Y对玉米浆(A)、磷酸氢二钾(B)、硝酸钠(C)、葡萄糖(D)的多项回归方程式:

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface test

Y=3.86-0.44A-0.031B-0.091C+8.667E-004D+0.18AB+0.13AC-0.16AD+7.200E-003BC-0.036BD+0.34CD-1.21A2-1.06B2-0.55C2-0.61D2

表3 ADD产量多项式回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance(ANOVA)for the quadratic polynomial model for dehydrogenases

2.5.2 响应面优化及分析 根据回归模型作出响应面图和等高线图,考察各因素交互作用[20]对ADD产量的影响,结果见图9。

图9 因素间交互作用的响应面分析Fig.9 Response surface analysis of the interaction of different factors

交互作用的大小可由等高线的形状来反映,若呈椭圆形,说明两因素的交互作用显著,若呈圆形则相反,而响应面曲线较陡也说明两因素交互作用显著。如图9所示,AB、AD、CD之间交互作用对ADD产量的影响显著,表现为响应曲线较陡。其中AB、AD为显著(p<0.05),CD为极显著(p<0.01)。

根据响应面结果分析计算,可得到Mycobacteriumsp. ZFZ321发酵转化植物甾醇产ADD的最佳培养基配方:玉米浆23.11 g/L、硝酸钠2.78 g/L、磷酸氢二钾1.95 g/L、葡萄萄糖8.97 g/L,在此条件下ADD的产量预测值可达3.97 g/L。

2.5.3 验证实验 考虑到实际操作的便捷性,将响应面优化结果校正为玉米浆23 g/L、硝酸钠2.8 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、葡萄萄糖9 g/L,在此条件下进行3次平行实验,得到的实际发酵96 h的ADD积累量达到最大值为(4.12±0.18) g/L,与预测值3.97 g/L的相对误差为3.83%,说明该方程与实际转化情况的拟合度较好,验证了所建模型的正确性,并且与初始菌Mycobacteriumsp. ZFZ的0.21 g/L相比,ADD产量提高了近18倍,为提高甾体药物雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮生产提供了一定的工业基础。

3 结果与讨论

本实验通过在产AD的Mycobacteriumsp. ZFZ菌株体内过表达高活性的3-甾酮-Δ1-脱氢酶，获得一株直接降解植物甾醇产ADD的菌株Mycobacteriumsp. ZFZ321。通过单因素实验确定了Mycobacteriumsp. ZFZ321发酵转化甾醇生产ADD的培养基成分;在单因素实验的基础上利用响应面试验设计,得到最优培养基条件为玉米浆23 g/L、硝酸钠2.8 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、葡萄糖9 g/L。在此条件下ADD产量为(4.12±0.18) g/L，接近理论预测值,说明该模型比较合理。通过培养基优化,相比初始菌Mycobacteriumsp. ZFZ,ADD产量提高了近18倍，远高于现有的研究水平[12]。

目前国内外利用微生物直接降解生产ADD的研究仍较少,大多都是利用脱氢酶以AD为底物，脱氢得到ADD,而且产量也不高[22]。本研究直接利用能够降解植物甾醇产AD的Mycobacteriumsp. ZFZ，体内过表达3-甾酮-Δ1脱氢酶,使分枝杆菌降解甾醇的同时一步获得ADD,减少了生产步骤,降低了成本。但发酵过程中，仍有部分底物没有被微生物所利用而损失,而且实际ADD可能被菌体降解导致产量与理论值仍有差距,因此下一步工作可利用基因工程切断ADD降解途径,并寻找合适的分散剂增大甾醇与细菌的接触，来进一步提高ADD的产量。