牟海军 赵 丹 石寒冰 毕红霞 姜云飞 刘国华

(齐齐哈尔医学院附属第三医院呼吸科，齐齐哈尔161000)

肺癌发病率及死亡率均居恶性肿瘤第一位，且早期发生转移[1]，而中医药在抗肿瘤方面具有重要的作用。中医药抗肿瘤的基本原则是益气养阴扶助正气、清热解毒祛除邪气。因此本课题应用清热解毒作用较强的重楼有效成分重楼皂苷Ⅰ，通过体外细胞实验，观察其对肺腺癌A549细胞侵袭转移及相关因子的影响，明确其抑制肿瘤侵袭转移的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1实验材料、试剂 F12K培养基(Sigma)；胎牛血清(Hyclone)；CCK8试剂(碧云天)；肺腺癌A549细胞(齐齐哈尔医学院岳丽玲主任惠赠)； 重楼皂苷Ⅰ(上海高创化学科技有限公司)；Transwell小室(Corning)；Western blot蛋白提取及浓度测定试剂(碧云天)； MMP-2、E-cad、GAPDH(Proteintech)；二抗(CST)；RNA提取试剂(TIANGEN)；Perfect real time-PCR试剂盒(TAKABA)；PCR引物设计及合成(上海生工)；CO2培养箱(Thermo Forma)；BX60F-3荧光照相显微镜(Olympus)；5082型酶联免疫检测仪(TECAN)； Bio-Rad Model 785型电转移仪； ChemiDocMP 全自动荧光和化学发光成像分析系统(伯乐公司)；7300荧光定量PCR仪(ABI)。

1.2方法

1.2.1应用CCK8法检测重楼皂苷Ⅰ对人肺腺癌 A549 细胞增殖的影响 取对数生长期的肺腺癌A549细胞，经消化、离心、重悬后制成单细胞悬液(密度为0.5×105个/ml)，按照每孔200 μl接种在96孔板中，接着将96孔板放入CO2培养箱中，培养24 h，待细胞完全贴壁后，加入不同浓度的重楼皂苷Ⅰ。重楼皂苷Ⅰ的浓度分别为：0.25、0.5、1、2、4、8、16 mg/L。实验另设空白对照组，每组6个复孔。加药48 h后每孔加入CCK溶液10 μl，放入CO2培养箱中继续培养2 h，最后用酶标仪检测各孔的吸光度值并记录实验结果，计算各组的增殖抑制率。抑制率=(1-实验组OD值/空白对照组OD 值)×100%。……