隋 双， 王 萍

(东北林业大学 林学院， 黑龙江 哈尔滨 150040)

笃斯越橘(VacciniumuliginosumL.)是我国重要的野生资源之一，主要分布在内蒙古、黑龙江、吉林、辽宁等地区[1]。它是一种果肉细腻、种子极小的小浆果。果实不仅营养丰富，而且含有有机酸、氨基酸、花色苷等独特的功能性成分[2]，具有防治心血管疾病、抗癌、抗衰老等多种功效[3-4]。

笃斯越橘极不耐贮藏，其深加工研究有利于缓解该产业发展的瓶颈。Sang等[5]研究结果表明，发酵过程可显著提高原料本身的抗氧化能力。发酵引起复合物底物分解和生物转化成相容的组分，从而调节产物性质或改变某些生物活性化合物的量[6]。用酵母控制发酵果汁，可长期保存其所有生物活性化合物(如抗氧化剂)和功能性物质[7]。乳酸菌在发酵过程中产生不同的代谢物，如有机酸、二氧化碳、乙醇、过氧化氢、二乙酰、细菌素、胞外多糖、风味成分、酶和营养物质[8]。植物乳杆菌能够进行乳酸发酵，特别是在高pH值条件下与酵母共接种[9]。醋酸菌可将乙醇氧化为醋酸，醋酸菌的加入将有效降低酒精发酵阶段所产生的乙醇含量。目前，同时接种酵母菌、植物乳杆菌和醋酸菌进行混合发酵笃斯越橘的研究鲜有报道。

本研究选用果酒酵母、植物乳杆菌和醋酸菌3种益生菌混合发酵笃斯越橘，采用Box-Benhnken中心组合实验优化发酵工艺，旨在得到一种总酚含量和抗氧化能力较高的笃斯越橘低醇发酵产品。

1 材料与方法

1.1 实验材料

笃斯越橘，黑龙江省大兴安岭； MRS培养基，自制(用于植物乳杆菌的培养)； GY培养基，自制(用于醋酸菌的培养)；脱氧核糖、2-硫代巴比妥酸、TPTZ ，上海源叶生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯或生物制剂。

1.2 实验菌种

葡萄酒·果酒专用酵母(Saccharomycescerevisiae)，安琪酵母股份有限公司；植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、巴氏醋酸杆菌沪酿1.01(AcetobacterpasteurianusHN 1.01)，东北林业大学食品微生物实验室保藏。

1.3 主要仪器

DH6000A型电热恒温培养箱，天津泰斯特仪器有限公司；5030-PVL型高压灭菌锅，长春百奥生物仪器有限公司；PB-10型酸度计，德国Sartorius公司；WYT-4型手持糖度计，泉州中友仪器有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1发酵基质的制备

取m(笃斯越橘)∶m(无菌水)=1∶6进行打浆，加入白砂糖调整发酵基质的初始糖度至15°Bx，加入1 mol/L小苏打水溶液调整发酵基质的初始pH值至4.80，经巴氏杀菌后备用。

1.4.2菌种比例的确定

设定酵母菌、植物乳杆菌和醋酸菌的菌种比例为1∶2∶1、2∶1∶1、1∶1∶2、1∶1∶1，分别以6%的接种量接入发酵基质中，发酵60 h后测定发酵液的pH值、还原糖、蛋白质、总酚、黄酮、原花青素、花色苷含量，以及·OH清除率和总抗氧化能力。

1.4.3单因素实验

1.4.3.1 发酵时间的确定

按菌种比例酵母菌∶植物乳杆菌∶醋酸菌=1∶2∶1以6%的接种量接入发酵基质，跟踪发酵液的pH值、还原糖、蛋白质、总酚含量，以及·OH清除率和总抗氧化能力的变化。

1.4.3.2 接种量的确定

以接种量1.5%、3%、6%、9%、12%接入发酵基质，发酵60 h后测定发酵液的pH值、还原糖、蛋白质、总酚含量，以及·OH清除率和总抗氧化能力。

1.4.3.3 发酵温度的确定

分别在28、33、38、43 ℃的培养箱恒温发酵，发酵60 h后测定发酵液的pH值、还原糖、蛋白质、总酚含量，以及·OH清除率和总抗氧化能力。

1.4.3.4 初始糖度的确定

添加白砂糖将发酵基质初始糖度分别调至9、12、15、18、21 °Bx，发酵60 h后测定发酵液的pH值、还原糖、蛋白质、总酚含量，以及·OH清除率和总抗氧化能力。

1.4.4测定方法

1.4.4.1 pH值的测定

采用pH计测定。

1.4.4.2 蛋白质含量的测定

采用考马斯亮蓝G-250法测定[10]。取1 mL稀释后的样品加入5 mL考马斯亮蓝溶液染色，室温静置5 min后，以水代替样品组作为空白，于波长595 nm处测定吸光值，根据标准曲线计算样品中蛋白含量。每组样品平行测定3次取平均值。

1.4.4.3 还原糖含量的测定

采用DNS法测定[11]。将样品进行适当稀释，取2 mL稀释后样品加入DNS显色液1.5 mL，混匀后放入沸水浴5 min，取出后迅速冷却至室温。用蒸馏水定容到25 mL，摇匀。在520 nm波长下测定吸光值。结果用葡萄糖当量表示。每组样品平行测定3次取平均值。

1.4.4.4 总酚含量的测定

采用福林酚法测定[12]。100 μL适当稀释后的样品加入试管中，加水7 mL，摇匀，再加0.5 mL福林试剂，充分摇匀，1 min之后，加入质量分数20%的Na2CO3溶液1.5 mL，混匀，最后加入0.9 mL蒸馏水，于25 ℃水浴条件下避光反应 1 h。在765 nm波长下测定吸光值，结果用没食子酸当量表示。每份样品平行测定3次取平均值。

1.4.4.5 黄酮含量的测定

根据文献[13]的方法，略有改动。0.5 mL的样品加入体积分数30%的乙醇至5 mL，加入质量分数5%的亚硝酸钠0.3 mL，摇匀。6 min后加入质量分数10%的硝酸铝0.3 mL，摇匀静置6 min后加入1.0 mol/L的氢氧化钠4 mL，反应15 min后于510 nm波长下测定吸光值，结果用芦丁当量值表示。每组样品平行测定3次取平均值。

1.4.4.6 原花青素含量的测定

采用香草醛—硫酸法[14]测定。精确移取0.5 mL样品于试管中，依次加入2.5 mL质量分数4%香草醛-甲醇溶液和2.5 mL浓硫酸—甲醇溶液，摇匀，于30 ℃水浴条件下避光反应20 min。用甲醇代替样品作为空白对照，在500 nm波长下测定反应体系的吸光值，结果用儿茶素当量值表示。每组样品平行测定3次取平均值。

1.4.4.7 花色苷含量的测定

采用pH示差法[15]测定。分别移取1 mL样品于试管中，用pH值1.0、4.5的缓冲溶液定容到10 mL，置于暗处反应达平衡后(pH值1.0为50 min，pH值4.5为80 min)分别在510、700 nm波长下测定吸光值，根据公式(1)计算花色苷质量浓度。每组样品平行测定3次取平均值。

(1)

式(1)中：ρ，mg/L；A，吸光度，A=(A510 nm,pH 1.0-A700 nm,pH 1.0)-(A510 nm,pH 4.5-A700 nm,pH 4.5)；ε，矢车菊花素-3-葡萄糖苷的消光系数，26 900；DF，稀释因子；M，矢车菊-3-葡萄糖苷的分子量，449.2。

1.4.4.8 ·OH清除率的测定

采用硫代巴比妥酸法(TBARS)测定，实验方法参照文献[15]并作适当修改。取0.25 mL稀释10倍的样品，以0.25 mL蒸馏水作为空白对照，向样品中加入0.5 mL PBS缓冲溶液(pH值7.4，100 mmol/L)、0.2 mL 2-脱氧-D-核糖(28 mmol/L)、0.4 mL Fe3+-EDTA (100 μmol/L FeCl3，104 μmol/L Na2EDTA，体积比1∶1)混匀，再加入0.2 mL H2O2(1 mmol/L)和0.2 mL抗坏血酸溶液(1 mmol/L)，在37 ℃条件下反应1 h。立即加入2 mL 28 g/L的三氯乙酸和2 mL 10 g/L的2-硫代巴比妥酸混匀，沸水浴20 min，然后放入冰水浴中终止反应。在室温下静置10 min，于532 nm波长下测定各样品吸光值，并根据式(2)计算·OH清除率。

·OH清除率=[1-(A1-A2)/A3] ×100%。

(2)

式(2)中：A1，加测定溶液后的吸光度；A2，加测定溶液，不加脱氧核糖溶液反应后的吸光值；A3，未加测定溶液时的吸光度。

1.4.4.9 总抗氧化能力的测定

采用铁离子还原/抗氧化力测定法(FRAP)[16]。取2.5 mL TPTZ溶液(用40 mmol/L HCl配置成10 mmol/L的TPTZ-HCl溶液)，25 mL醋酸(100 mmol/L，pH值3.6)，2.5 mL FeCl3(20 mmol/L)，充分混匀后配置FRAP工作液。取0.1 mL样品加入试管中，以100 μL蒸馏水作为空白对照，向各试管中加入4.9 mL FRAP工作液(现用现配)，混匀，在37 ℃水浴反应30 min，593 nm波长下测定吸光值。根据标准曲线计算出样品的总抗氧化能力。

1.5 Box-Benhnken中心组合实验设计

根据单因素实验结果，以总酚含量和·OH清除率为响应值，利用Box-Benhnken设计进行响应面分析。Box-Benhnken中心组合实验设计见表1。

表1 Box-Benhnken中心组合实验设计因素水平

1.6 数据分析

所有实验数据以x±sd表示，采用SPSS 20.0进行数据处理，Design-Expert 8.0.6进行实验设计及分析，以p<0.05或p<0.01为统计学差异。

2 结果与分析

2.1 菌种比例对不同指标的影响

菌种比例的确定结果见表2。

从表2的结果比较发现，第1组的总酚、黄酮、原花青素、花色苷含量均稍高于其他3组。第1组·OH清除率和总抗氧化能力均显著高于其他3组(p<0.05)。由于实验目的是通过发酵使发酵液中总酚含量较高，同时抗氧化能力较强，故综合考虑选择第1组菌种比例(酵母菌∶植物乳杆菌∶醋酸菌=1∶2∶1)进行发酵。在混合发酵中，发酵前期酒精发酵占主导，后期乳酸发酵占主导，醋酸发酵在酒精发酵之后，乳酸发酵是活性成分增加的主要原因，第1组中乳酸菌为优势菌，这是第1组活性物质含量高于其他3组的主要原因[17-18]。酵母菌、乳酸菌及醋酸菌本身具有抗氧化能力，果蔬中的抗氧化成分主要有多酚类、类胡萝卜素、花色苷和生育酚等，酚类化合物大多可以作为还原剂、金属螯合剂、单线态氧猝灭剂和氢供体在体系中来发挥抗氧化功能[19]，活性物质含量的增加也是抗氧化能力提高的原因之一，因此第1组的抗氧化能力显著高于其他3组(p<0.05)。酒精发酵占主导时会大量利用还原糖，第3组酵母菌所占比例小，优势菌为醋酸菌，因此第3组剩余还原糖含量显著高于其他3组(p<0.05)。

表2 菌种比例对发酵的影响

第1组菌种比例为1∶2∶1，第2组菌种比例为2∶1∶1，第3组菌种比例为1∶1∶2，第4组菌种比例为1∶1∶1；同行中不同字母表示数值间差异性达到显著水平(p<0.05)。

2.2 单因素实验结果

2.2.1发酵时间对不同指标的影响

图中不同字母表示数值间差异性达到显著水平(p<0.05)，下同。图1 发酵时间对发酵的影响Fig.1 Effect of fermentation time on components and antioxidant activities of Vaccinium uliginosum L.

发酵过程中pH值、蛋白质含量、还原糖含量、总酚含量、·OH清除率和总抗氧化能力随发酵时间的变化如图1。

通过计算温度条件下各水样的矿物饱和指数(表3)发现，方解石、文石、白云石的饱和指数均大于0，处于过饱和状态，而ZGJ04方解石及文石饱和指数近似于0，接近平衡状态，说明碳酸盐及硅酸盐类矿物出现有沉淀的现象；石英、玉髓饱和指数均小于0，ZGQ08玉髓接近饱和状态。萤石能否达到平衡状态，主要取决于热水中的电导率，研究区萤石饱和指数处于-1.06～0.1之间，极有可能与冷水的混合有关。

如图1所示，总酚含量、·OH清除率、总抗氧化能力随发酵时间呈先升高后降低变化，并在60 h达到最高点；pH值与还原糖含量随发酵时间呈下降趋势；蛋白质含量呈波动升高后下降的变化趋势。由于实验的目的是通过发酵使发酵液中总酚含量较高，同时抗氧化能力较强，发酵至60 h时发酵液的总酚含量及抗氧化能力均最高，故综合考虑选择60 h作为发酵时间。发酵至72 h时总酚含量及抗氧化能力有所下降的主要原因可能是此时活菌数下降，菌系活力降低，而总酚含量的降低也是抗氧化能力下降的原因之一。

2.2.2接种量对不同指标的影响

接种量单因素实验结果如图2。

如图2所示，pH值、蛋白质含量、还原糖的含量随接种量的增加基本呈递减的趋势，发酵液中的微生物在不断的产酸，分解与利用还原糖和蛋白质，随着接种量的加大，程度在加深；与其他接种量比较，总酚含量、·OH清除率、总抗氧化能力均在6%接种量时，表现出较高的活性。当接种量低于6%时发酵不充分，当接种量高于6%时发酵液中微生物数量过多导致底物浓度不足以满足其生长需求，同时激烈的竞争会导致底物利用不合理，因此总酚含量及抗氧化能力均在接种量为6%时出现最大值。

图2 接种量对发酵的影响Fig.2 Effect of inoculation volume on components and antioxidant activities of Vaccinium uliginosum L.

2.2.3发酵温度对不同指标的影响

发酵温度单因素实验结果如图3。

如图3所示，pH值、还原糖含量在38 ℃时最低，与其他温度相比，发酵程度较深；蛋白质含量并无明显差异。与其他发酵温度比较，总酚含量、·OH清除率、总抗氧化能力均在发酵温度38 ℃时，表现出较高的活性。当发酵温度低于38 ℃时，对于植物乳杆菌而言，并未达到其发酵最佳温度，发酵不充分，当发酵温度高于38 ℃时，过高的发酵温度对酵母菌及醋酸菌有一定的抑制作用，因此总酚含量及抗氧化能力均在发酵温度为38 ℃时出现最大值。

2.2.4初始糖度对不同指标的影响

如图4所示，pH值在15°Bx时最低，剩余还原糖含量随初始糖度的增加呈递增趋势，蛋白质含量并无明显差异；与其他初始糖度比较，总酚含量、·OH清除率、总抗氧化能力均在初始糖度15°Bx时，表现出较高的活性。当初始糖度低于15°Bx时，碳源不充足，发酵不充分；当初始糖度高于15°Bx时，过高的碳源浓度导致发酵液渗透压升高抑制微生物生长，导致微生物代谢不充分，因此总酚含量及抗氧化能力均在初始糖度为15°Bx时出现最大值。

图3 发酵温度对发酵的影响Fig.3 Effect offermentation temperature on components and antioxidant activities of Vaccinium uliginosum L.

图4 初始糖度对发酵的影响Fig.4 Effect of initial sugar content on components and antioxidant activities of Vaccinium uliginosum L.

2.3 Box-Benhnken中心组合实验结果

Box-Benhnken中心组合实验设计及结果、方差分析分别见表3、表4。

将实验数据进行拟合，分别得到总酚含量和·OH清除率的模拟方程，见式(3)、式(4)：

Y1=53.26-0.35A-0.55B+0.54C-0.092D-
0.12AB+0.17AC+0.29AD+0.18BC-0.69BD-
0.065CD-1.95A2-0.43B2-2.48C2-1.69D2；

(3)

Y2=83.64+1.79A+0.98B+0.069C+
1.52D-1.15AB+0.16AC-0.93AD-
0.76BC-0.63BD+0.025CD-2.41A2-
2.01B2-1.45C2-2.33D2。

(4)

由表4的方差分析结果可知，将总酚含量作为响应值，该模型p<0.01，说明该模型极显著；失拟误差p>0.05，说明没有产生失拟现象。R2为0.9598，说明拟合度良好，方程的显著性及可靠性极高。方程一次项系数B、C和二次项系数A2、B2、C2、D2具有极显著性，方程一次项系数A和交互性BD具有显著性。各因素对总酚含量影响的大小顺序依次为接种量、发酵温度、发酵时间。接种量和初始糖度交互作用对总酚含量的影响具有显著性。发酵时间、接种量、发酵温度和初始糖度交互作用对总酚含量影响的响应面分析见图5。将·OH清除率作为响应值，该模型p<0.01，说明该模型极显著；失拟误差p>0.05，说明没有产生失拟现象。R2为0.928 0，说明拟合度良好，方程的显著性及可靠性极高。方程一次项系数A、B、D和二次项系数A2、B2、C2、D2具有极显著性，交互项AB具有显著性。各因素对·OH清除率影响的大小顺序依次为发酵时间、初始糖度、接种量。发酵时间和接种量交互作用对·OH清除率的影响具有显著性。发酵时间、接种量、发酵温度和初始糖度交互作用对·OH清除率影响的响应面分析见图6。

表3 Box-Benhnken中心组合实验设计及结果

表中数据为3组平行实验结果平均值。

2.4 优化发酵工艺条件的确定及验证

利用Design-Expert.V 8.0.6软件的optimization功能，得到笃斯越橘混合菌发酵的优化工艺条件：发酵时间61.45 h，接种量5.93%，发酵温度38.44 ℃，初始糖度15.43°Bx；此发酵条件下发酵后的笃斯越橘总酚质量浓度达53.19 mg/100 mL，·OH清除率达83.95%。为了验证模型预测理论值的准确性和真实性，同时为了方便实际操作，将优化发酵工艺的条件调整为发酵时间62 h，接种量6%，发酵温度38.5 ℃，初始糖度15.5°Bx。在此优化条件下进行3次平行实验，得到发酵液中总酚质量浓度达(53.27±0.16)mg/100 mL，·OH清除率达(83.88±0.19)%。结果与预测值相差甚小，因此，采用响应面法优化的笃斯越橘混合菌发酵工艺条件准确合理，有实际指导意义。

2.5 阳性对照结果

优化后的笃斯越橘发酵液的·OH清除率阳性对照结果见表5。

由表5可以看出，优化后的稀释10倍的笃斯越橘发酵液的·OH清除率显著高于作为阳性对照的2 mg/mL维生素C溶液(p<0.01)，其抗氧化活性约为2 mg/mL维生素C溶液的5倍。

表4 Box-Benhnken中心组合实验方差分析

p<0.05为显著，用“*”表示；p<0.01为极显著，用“**”表示。

图5 发酵时间、接种量、发酵温度和初始糖度交互作用对总酚含量的影响Fig.5 Response surface plot of interaction among fermentation time, inoculation volume, fermentation temperature, and initial sugar content on total phenol content

图6 发酵时间、接种量、发酵温度和初始糖度交互作用对·OH清除率的影响Fig.6 Response surface plot of interaction among fermentation time, inoculation volume, fermentation temperature, and initial sugar content on hydroxyl radical scavenging rate

0.25mL的10%发酵液0.25mL的2 mg/mL维生素C·OH清除率/%83.88±0.19a16.16±0.14b

同行中不同字母表示数值间差异性达到显著水平(p<0.01)。

3 结论与讨论

本实验以笃斯越橘为原料，选择果酒酵母、植物乳杆菌和醋酸菌为发酵菌种对发酵工艺进行优化。得到的优化发酵工艺条件为：酵母菌、植物乳杆菌、醋酸菌菌种比例1∶2∶1，发酵时间62 h，接种量6%，发酵温度38.5 ℃，初始糖度15.5°Bx。优化后笃斯越橘发酵液的总酚质量浓度达(53.27±0.16)mg/100 mL，稀释10倍的笃斯越橘发酵液对·OH清除率达(83.88±0.19)%，与发酵前对比分别提高了56.91%和34.34%，其·OH清除率显著高于阳性对照组(p<0.01)。实验结果表明，发酵前后总酚含量与·OH清除率均显著提高(p<0.01)，这与其他研究人员研究结果相一致[20-21]。Kwaw等[20]研究结果表明乳酸发酵显著影响了饮料中总酚、花青素和类黄酮的含量，乳酸菌在发酵过程中将复合多酚水解成更简单、更具生物活性的化合物，这是总酚含量增加的主要原因。浆果含有高含量的维生素C和多酚，已知维生素C和多酚在浆果中以糖苷的形式存在，当用糖苷水解酶从浆果中除去葡萄糖时，浆果的抗氧化活性得到改善，且天然化合物的抗氧化活性在真菌、酵母菌或乳酸菌发酵后增加[21]，这是抗氧化能力显著提高的主要原因。对比蓝莓酵素及树莓酵素，本实验所得笃斯越橘混合菌发酵产品的·OH清除率显著高于管章瑞等[22]、程勇杰等[23]的研究结果(p<0.01)。