吴家鑫，刘敏，尚飞，宋敏，张传良，张刚，徐金雷，齐鹏，肖进，郭丽清

(1.中牧实业股份有限公司/农业部兽用生物制品与化学药品重点实验室/北京市兽用多肽疫苗设计与制备工程技术研究中心，北京 100095；2.北京化工大学生命科学与技术学院/北京市生物加工过程重点实验室，北京 100029；3.北京化工大学分析测试中心，北京 100029)

大环内酯类抗生素( Macrolide antibiotics) 是一类具有大环内酯环这种基本化学结构和相似抗菌谱的弱碱性抗菌化合物[1]，通常为14～16元环，在大环上通过羟基，以苷键与1～ 3个去氧氨基糖或二甲氨基糖缩合成碱性苷[2]，其对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、支原体属、衣原体属等病原体都具有较强的抑制能力，广泛应用于畜牧养殖业[3-5]。大环内酯类抗生素通过干扰细菌蛋白质的合成起到抑菌和杀菌作用[6-7]。在蛋白质的转录过程中，大环内酯类抗生素与50s核糖体亚基实现可逆结合，从而阻止肽链延伸[8-9]。由于大环内酯类抗生素在畜牧业中的大量使用，因此，建立一种快速筛选鉴别动物体内大环内酯类抗生素的方法具有重要意义。超高效液相色谱(UPLC)技术具有超高压、超高灵密度、超高分离度等特点[10-11]。高分辨四级杆飞行时间质谱(Q-TOF-MS)具有选择性高、受基质干扰小、方法建立过程简单等特点[12]，可以同时获取母离子及其二级质谱碎片离子的精确质量数，准确推算可能的分子式，从而对化合物的结构和裂解规律加以确证[13-15]。超高效液相色谱-高分辨率四极杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOP-MS)不仅可以有效提高抗生素快速定性筛查的可靠性，还可以获得较高灵敏度的定量结果[16-18]。

本研究采用超高效液相色谱串联高分辨四极杆飞行时间质谱，同时检测猪血浆中常见大环内酯类抗生素的母离子及其二级质谱分析碎片离子的精确质量数、保留时间，建立数据库，快速筛查鉴别猪血浆中的大环内酯类抗生素。本方法实用性强，后期可对数据库进行扩充，对大环内酯类抗生素的快速筛查鉴别具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 Agilent 7890B超高效液相色谱仪，配备二元梯度泵，真空在线脱气机，自动进样器，Agilent 6540Q-TOF质谱仪；仪器控制、数据采集软件及数据分析软件采用Agilent公司的Mass Hunter系统。

螺旋霉素，Dr Ehrenstorfer GmbH；麦迪霉素，中国药品生物制品检定所；地红霉素、罗红霉素、交沙霉素、阿奇霉素、克拉霉素，中国食品药品检定研究院；红霉素、替米考星、泰乐菌素、吉他霉素，中国兽医药品监察所；泰万菌素、泰地罗新、加米霉素、泰拉霉素，中牧实业股份有限公司自制对照品(经核磁鉴定)；甲酸， Fisher公司，色谱纯；乙腈，Fisher公司，质谱纯。

1.2 超高效液相色谱-高分辨四极杆飞行时间质谱检测方法 超高效液相色谱条件：Agilent Extend-C18色谱柱(50×2.1 mm，1.8 μm)，柱温40 ℃。流动相：A相为0.1%甲酸水溶液(含2 mmol/L乙酸铵)，B相为乙腈；流速0.4 mL/min。进样体积为3 μL；梯度洗脱程序：0.00→1.00 min，95%→95%A；1.00→10.00 min，95%→50%A；10.00→10.10 min，50%→95%A；10.10→13.00 min，95%→95%A。

质谱条件：电喷雾正离子源(ESI+)，电压3500 V， 干燥气温度 300 ℃, 锥孔电压65 V，鞘气温度350 ℃，干燥气和鞘气流量分别为8、11 L/min，雾化气压力35 psi，全扫描模式(10～2000 amu)。

1.3 溶液配制

1.3.1 对照品溶液的配制 取上述各抗生素对照品适量，利用甲醇将其溶解。再将各抗生素甲醇溶液混合制成抗生素对照品储备溶液。

1.3.2 样品溶液的制备 准确称量2.50 g猪血浆，加入甲醇稀释定容至5.00 mL，漩涡振荡30 s，待混合均匀后超声提取15 min，14000 r/min 离心10 min，取上层清液，过0.45 μm有机滤膜到进样瓶中，供检测使用。

2 结果与分析

2.1 UPLC-Q-TOF-MS检测大环内酯类抗生素数据库的建立 数据库收录了常见的大环内酯类抗生素的(共计26 种化合物)相关信息,包括大环内酯类抗生素类化合物的分子式、精确相对分子质量数、准分子离子峰精确质量数、主要碎片峰的精确质量数和保留时间(表1)。

表1 26种大环内酯类抗生素类化合物的分子式、精确相对分子质量数、准分子离子峰精确质量数、保留时间以及主要碎片峰的精确质量数Tab 1 Formula、accurate mass、accurate-mass of quasi-molecular ion, retention time and accurate-mass of main fragment ion of 26 common macrolide antibiotics

续表

交沙霉素二级质谱电压为35 V，其余二级质谱电压为40 V

2.2 猪血浆中大环内酯类抗生素精确质量数快速筛查及初步鉴别 本研究建立了多种大环内酯类抗生素精确质量数的数据库。通过对UPLC-Q-TOF-MS分析得到的精确质量数对猪血浆中大环内酯类抗生素进行快速筛查。高分辨质谱可以在全扫描模式下以较小的离子窗口提取离子，从而有效降低背景噪音，提高信噪比[19]。本研究以±25 mDa为质量窗口，以[M+H]+为目标离子进行猪血浆中大环内酯类抗生素的筛选。

对一份猪血浆样品进行UPLC-Q-TOF-MS分析，获得正离子模式总离子流图，然后通过数据库的泰地罗新和红霉素精确相对分子质量对总离子流图进行信号提取，以±25 mDa为质量窗口信号(分别为m/z734.50～734.55和m/z734.45～734.45)提取得到图1～图3。图1中有明显的提取离子流峰，保留时间为2.598 min，其对应[M+H]+峰为m/z734.5327(图2)，以Mass hunter软件进行匹配度分析，泰地罗新的实际测量值与理论计算值匹配良好。图3中有明显的提取离子流峰，保留时间为5.952 min，其对应[M+H]+峰为m/z734.4705(图4)，以Mass hunter软件匹配度分析，红霉素的实际测量值与理论计算值匹配良好。由此可见UPLC-Q-TOF-MS通过选取较小的离子窗口提取离子，可以将相对分子质量较为接近的物质进行区分。以上结果可以看出，通过高分辨质谱对精确质量数进行分析，可以完成对猪血浆中大环内酯类抗生素的快速筛查及初步鉴定。

图1 泰地罗新提取离子流谱图Fig 1 Extracted ion flow chart of Tildipirosin

图2 泰地罗新一级质谱质谱图Fig 2 MS mass chromatogram of Tildipirosin

图3 红霉素提取离子流谱图Fig 3 Extracted ion flow chart of Erythromycin

图4 红霉素一级质谱质谱图Fig 4 MS mass chromatogram of Erythromycin

2.3 通过保留时间及二级质谱碎片分析进行确认鉴别 UPLC-Q-TOF-MS通过对精确质量数筛选，实现了对猪血浆中大环内酯类抗生素的初步筛查鉴定，在此基础上可以使用标准品通过保留时间进一步确认。但是，某些大环内酯类抗生素具有多个组分，例如吉他霉素具有11个组分[20]，缺少单一组分的标准品。甚至某些大环内酯类抗生素存在组分之间的相互转化[21]，例如泰拉霉素，同样缺少单一组分的标准品。对于这些缺少标准品的大环内酯类抗生素可以通过二级质谱分析获得化合物的碎片信息进行确认鉴别。UPLC-Q-TOF-MS可以同时获取整个色谱分离阶段的每个可检测峰中的所有母离子及其二级质谱碎片离子的精确质量数、保留时间，配合数据软件的高通量数据分析，可以有效简化化合物的筛查和确证过程[19]。对于已经筛选到的两种大环内酯类抗生素，通过保留时间的对比进一步确定为泰地罗新和红霉素。在正离子模式下对这两个化合物进行了二级质谱分析，其二级质谱特征碎片离子存在明显的差异，泰地罗新二级质谱图(图5)中的碎片按照丰度由高到低为m/z98.0968、174.1125和132.1020，而红霉素二级质谱图(图6)中的碎片按照丰度由高到低为m/z158.1175、83.0491和116.1068，由此可见通过二级质谱分析在没有标准品的条件下也可以对大环内酯类抗生素进行进一步鉴别和区分。

图5 泰地罗新二级质谱质谱图Fig 5 MS/MS mass chromatogram of Tildipirosin

图6 红霉素二级质谱质谱图Fig 6 MS/MS mass chromatogram of Erythromycin

2.4 重复性及灵敏度 在最佳仪器条件下，以大环内酯类抗生素的提取离子流峰面积为考察指标，对UPLC-Q-TOF-MS方法的重复性进行了验证。重复进样6次，结果表明，提取离子流峰面积的RSD值均低于5. 53%；保留时间的RSD值均低于4.82%，说明该方法的重复性良好。由于吉他霉素的11种组分缺少相应标准品，泰拉霉素的2种组分存在相互转化的现象，因此，只能对剩余的13种抗生素进行检测限分析。以信噪比S/N=3为检测限(LOD)，剩余13种大环内酯类抗生素的检测限在1.00～8.00 ng/g范围内(表2)，该方法可以满足猪血浆中大环内酯类抗生素快速筛选的需要。

表2 13种抗生素检测限Tab 2 Limit of detection(LOD) of 13 macrolide antibiotics

3 结 论

本研究利用超高效液相色谱串联高分辨四极杆飞行时间质谱同时获取猪血浆中常见大环内酯类抗生素的母离子及其二级质谱分析碎片离子的精确质量数、保留时间三种信息，建立相关数据库，快速筛查鉴别猪血浆中的大环内酯类抗生素。随着兽药科学的不断发展，新的大环内酯类抗生素会不断涌现，因此，本研究建立的猪血浆的大环内酯类抗生素数据库需要逐步进行补充，以满足今后检测的实际需求。