杜吉革，朱真，薛麒，赵俊杰，彭小兵，张秀坤，李启红，印春生，姚文生，康凯，陈小云

(中国兽医药品监察所，北京100081)

产气荚膜梭菌是一种重要的人畜共患菌[1-3]，不仅威胁着人类的健康，而且对畜牧业造成了巨大的经济损失[4-6]。根据该菌产生毒素的种类，可分为A、B、C、D、E五个毒素型[7]。其中，对养牛业危害最大的是A型，由于病牛往往无任何前驱症状，突然发作死亡[8-9]。因此，疫苗免疫是防制该病的有效手段。在预防羊的产气荚膜梭菌病方面，虽然产气荚膜梭菌灭活疫苗，达到了一定的效果，但该类疫苗制备过程冗杂，抗原成分复杂，有效抗原量较低。如大剂量的肌肉注射会破坏牛肉的品质。因此，提供安全、纯净、有效的抗原对未来预防该菌感染具有重要意义。

成熟的α毒素由N-末端和C-末端两个结构域构成[10]，是一种依赖于Zn2+的金属酶。其中，第56位和第130位的天冬氨酸是Zn2+结合位点，以上两个氨基酸位点的突变能够明显降低α毒素的活性[11]。Alberto等[12]的研究结果发现，Y275N和 D336N的溶血活性只占野生型毒素的11%，细胞毒性则分别降为野生型毒素的十万分之一和千分之一。在亚单位疫苗的研制中，增加Th细胞表位和佐剂能够提高疫苗的免疫原性。口蹄疫病毒VP4蛋白的第20-35位氨基酸被证实是一种良好的Th细胞表位[13]。此外，细菌的鞭毛蛋白(flagellin)作为免疫佐剂能够诱发机体产生更强的体液免疫与细胞免疫应答[14]。

为了降低因单个氨基酸突变在大规模生产中生物安全隐患，通过A型产气荚膜梭菌(C57-1株)CPA的56、130、275和336位氨基酸位点进行突变，同时引入VP4蛋白的Th细胞表位和鞭毛蛋白N末端第84-101位氨基酸(FN)的编码序列，通过原核系统表达并纯化重组蛋白，并对其毒力和免疫原性进行研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料 A型产气荚膜梭菌C57-1株、A型产气荚膜梭菌C57-1株天然毒素、A型产气荚膜梭菌毒素抗血清及pET-30a(+)(以下简称pET)均为中监所保存；1.5～2.0 kg普通级日本大耳白兔和16～18 g ICR小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；感受态细胞Top10和BL21(DE3)购自北京全式金生物技术有限公司；Montanide ISA 201佐剂购自法国赛彼科(seppic)公司；Ni-IDA亲和层析介质试剂盒、蛋白Marker、Western blot Marker，均购自南京金斯瑞生物科技有限公司; 高保真PCR酶(KFX-401S)购自东洋坊公司；premix Taq version 2.0、DNA Marker购自Takara公司。T4 DNA连接酶、DNA凝胶回收试剂盒购自Promaga公司；限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ购自NEB公司；抗His标签单抗、Bradford蛋白浓度测定试剂盒，购自碧云天生物技术有限公司；LB培养基购自北京中海生物科技有限公司。

1.2 基因合成及密码子优化 以前期获得的A型产气荚膜梭菌C57-1株CPA编码基因为模版进行密码子优化并引入D56G、D130G、Y275N和D336N等4个氨基酸突变。此外，在突变基因5'端添加VP4蛋白的Th细胞表位和鞭毛蛋白N末端第84-101位氨基酸的编码序列，在突变基因3'端添加6*His标签蛋白编码序列。由中美泰和公司人工合成基因片段GTFNCPAm4。

1.3 CPA原核表达载体的构建 以GTFNCPAm4为模板，采用引物对1F/1R进行PCR扩增。其中上游引物1F序列为：5'- CCCGGATCCATGTCCATAATC-3'，引入限制性内切酶BamHⅠ位点(下划线部分)及保护性碱基；下游引物1R序列为：5'-CCGCTCGAGTTAGTGGTGATGG，引入限制性内切酶XhoⅠ位点(下划线部分)及保护性碱基。PCR体系为50 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性4 min；98 ℃变性10 s，56 ℃退火30 s，68 ℃延伸2 min，共33个循环；最后68 ℃延伸7 min。

回收目的条带，采用BamHⅠ/XhoⅠ双酶切消化后，与经过相同酶切消化的pET载体连接。将连接好的质粒转化Top10感受态细胞，挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37 ℃振荡培养过夜，提取质粒。对所提质粒进行PCR和双酶切鉴定，将鉴定结果为阳性的质粒送中美泰和公司测序，测序正确的质粒命名为pTFNCPAm4。

1.4 重组蛋白的表达与鉴定 将质粒pTFNCPAm4和空载体pET分别转化BL21(DE3)感受态细胞，并分别在15 ℃和37 ℃的条件下用IPTG诱导表达，收集菌体，超声破碎后分别收集上清和沉淀，采用SDS-PAGE检测重组蛋白的表达情况及其可溶性，并以BSA蛋白为标准，利用灰度扫描的方法进行相对表达量和可溶性比例的统计，将表达的重组蛋白称为rTFNCPAm4。采用Western blot方法，以抗His标签蛋白抗体为一抗，对rTFNCPAm4做进一步的鉴定。

1.5 重组蛋白的纯化及Western blot鉴定 对获得的包涵体进行纯化和复性，参照文献[15]方法进行操作，最终获得纯化蛋白rTFNCPAm4。

1.6 纯化蛋白的鉴定 纯化复性后的rTFNCPAm4(0.5 μg)经SDS-PAGE电泳后转印至PVDF膜上，以A型产气荚膜梭菌毒素抗血清为一抗，HRP标记的山羊抗兔IgG(1∶10000)为二抗进行孵育，按照底物显色试剂盒说明进行显色，检测纯化的rTFNCPAm4与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清的反应情况。

1.7 重组蛋白的毒力测定

1.7.1 体外毒性检测 制备卵黄琼脂平板，分别取10倍浓缩的A型产气荚膜梭菌天然毒素、天然毒素原液、肉干胃酶消化汤和rTFNCPAm4各10 μL 点于平板上，37 ℃温箱培养1 h[16]。

制备1%的绵羊红细胞悬浮液，分装于EP管中，500 μL/管。分别取50 μL 的rTFNCPAm4及10倍系列稀释的A型产气荚膜梭菌天然毒素，加入装有绵羊红细胞悬浮液的EP管中，37 ℃温箱培养1 h后静置一段时间。同时设置肉肝胃酶消化汤、蛋白溶解液和dd H2O作为对照[17]。

1.7.2 体内毒性检测 将16～18 g ICR小鼠随机分为6组，每组5只。分别以1 μg(5.5×101μg/kg)、10 μg(5.5×102μg/kg)以及100 μg(5.5×103μg/kg)三个注射剂量尾静脉注射rTFNCPAm4，同时设置肉肝胃酶消化汤和蛋白溶解液作为阴性对照以及1个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素的阳性对照。样品用明胶缓冲液进行稀释，注射的液体总体积为200 μL，观察24 h，记录小鼠的存活状态。

1.8 免疫原性分析

1.8.1 免疫程序 选用对A型产气荚膜梭菌毒素的中和效价为0的家兔，进行重组蛋白rTFNCPAm4的免疫[15]。

1.8.2 血清中和抗体效价测定 采用血清中和的方法测定兔血清的A型产气荚膜梭菌毒素中和效价[15]。

1.8.3 攻毒试验 二免后21 d，对免疫组及对照组所有家兔通过耳缘静脉各注射1个MLD剂量的A型产气荚膜梭菌毒素，观察5 d，记录家兔的死亡情况。根据免疫组及对照组家兔的死亡情况，判定试验疫苗的免疫保护效力。

2 结 果

2.1 CPA突变体原核表达重组质粒的构建 采用引物1F/2R进行PCR扩增，扩增片段经酶切后克隆至pET载体上。获得的重组质粒双酶切电泳结果见图1，酶切后出现大小约5 kb的载体DNA片段，以及大小约1527 bp的目的基因片段，与预期相符。测序结果表明，插入的外源基因序列正确，将此质粒命名为pTFNCPAm4。

1: DL5000 DNA相对分子质量标准; 2: pTFNCPAm4的BamHⅠ和XhoⅠ的双酶切鉴定1: DL5000 DNA Marker; 2: pTFNCPAm4 digested with BamH Ⅰ and Xho Ⅰ图1 重组原核表达质粒pTFNCPAm4的酶切鉴定Fig 1 Identification of recombinant prokaryotic expression plasmids pTFNCPAm4

2.2 CPA突变体的原核表达鉴定 将pTFNCPAm4以及pET分别转化BL21(DE3)感受态细胞并诱导表达。SDS-PAGE和Western blot检测结果显示，BL21(DE3)菌体在15 ℃和37 ℃的条件下，rTFNCPAm4均以包涵体的形式表达(图2A)，分子量约为58 kD，且能与抗His标签抗体发生反应(图2B)，与预期相符。考虑到诱导时间，我们确定rTFNCPAm4最适诱导表达条件为37 ℃，诱导表达4 h，收获裂解后的沉淀蛋白，用于后续的纯化。

2.3 rTFNCPAm4的纯化与鉴定 如图3所示，按照Ni-IDA亲和层析介质试剂盒说明书对以包涵体形式表达的rTFNCPAm4进行纯化，收集纯度较高的Lane 5～9洗脱液进行透析和复性，最终获得的蛋白浓度为0.85 mg/mL。将纯化后的rTFNCPAm4经SDS-PAGE电泳后转印到PVDF膜上进行Western blot检测。结果显示，rTFNCPAm4能够与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清反应(图4)。

2.4 rTFNCPAm4的毒力测定

2.4.1 rTFNCPAm4在检测范围内无卵磷脂酶和溶血活性 在37 ℃温箱培养1 h后，可见卵黄琼脂平板上10倍浓缩的A型产气荚膜梭菌毒素和毒素原液均出现特异的水解卵黄产生的乳浊反应现象，而肉肝胃酶消化汤和纯化后的rTFNCPAm4没有出现上述现象(图5)。

在37℃温箱培养1h后静置，可见101～105倍稀释的天然毒素使绵羊红细胞发生完全溶血，rTFNCPAm4及肉肝胃酶消化汤、蛋白溶解液及ddH2O对照组均无溶血现象(图6)。

2.4.2 rTFNCPAm4对小鼠的毒力检测 结果如表1所示，rTFNCPAm4注射组，以及蛋白溶解液、肉肝胃酶消化汤2个阴性对照组小鼠，在注射后24 h均存活，未见任何异常，而注射1个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素后，小鼠在24 h内全部死亡，说明rTFNCPAm4已成功减毒，在检测范围内对小鼠无致死性。

A.重组蛋白表达的SDS-PAGE鉴定；B.重组蛋白与抗His单抗反应的Western blot M1. 蛋白Marker；M2. Western blot Marker；PC1. BSA (1 μg)；PC2. BSA (2 μg)；pET. pET 37 ℃、4 h诱导的细胞裂解物；1. pTFNCPAm4，15 ℃、16 h诱导的细胞裂解物；2. pTFNCPAm4，37 ℃、4 h诱导的细胞裂解物；pET 1.pET，37 ℃、4 h诱导的细胞裂解上清；pET2. pET，37 ℃、4 h诱导的细胞裂解沉淀；3. pTFNCPAm4，15 ℃、16 h诱导的细胞裂解上清；4. pTFNCPAm4，15 ℃、16 h诱导的细胞裂解沉淀；5. pTFNCPAm4，37 ℃、4 h诱导的细胞裂解上清；6. pTFNCPAm4，37 ℃、4 h诱导的细胞裂解沉淀A.The identification of recombinant protein expression by SDS-PAGE;B.The identification of recombinant protein with anti-His monoclonal antibody by Western blot M1.protein Marker; M2. Western blot Marker；PC1.BSA (1 μg); PC2.BSA (2 μg); pET.The cell lysates of pET induced with IPTG for 4 h at 37 ℃;1.The cell lysates of pThCPAm4 induced with IPTG for 16 h at 15 ℃; 2.The cell lysates of pTFNCPAm4 induced with IPTG for 4 h at 37 ℃;pET1.The supernatant of cell lysates of pET induced with IPTG for 4 h at 37 ℃; pET2.The precipitation of cell lysates of pET induced with IPTG for 4 h at 37 ℃;3.The supernatant of cell lysates of pTFNCPAm4 induced with IPTG for 16 h at 15 ℃; 4.The precipitation of cell lysates of pTFNCPAm4 induced with IPTG for 16 h at 15 ℃; 5.The supernatant of cell lysates of pTFNCPAm4 induced with IPTG for 4 h at 37 ℃; 6.The precipitation of cell lysates of pTFNCPAm4 induced with IPTG for 4 h at 37 ℃图2 rTFNCPAm4的原核表达与鉴定Fig 2 Prokaryotic expression and identification of rTFNCPAm4

M:蛋白Marker; 1:包涵体溶解离心后上清；2:上清与Ni-IDA孵育后流出液；3-4:50 mmol/L Imidazole的洗脱液；5-9:300 mmol/L Imidazole的洗脱液M:protein Marker; 1:The supernatant of dissolved inclusion bodies; 2:The flow-through from Ni-IDA resin after incubated with supernatant;3-4:The elution from Ni-IDA resin washed with elution buffer(contain 50 mmol/L Imidazole ); 5-9:The elution from Ni-IDA resin washed with elution buffer (contain 300 mmol/L Imidazole)图3 rTFNCPAm4的纯化Fig 3 Purification of rTFNCPAm4

M. 蛋白Marker；1. pET 37 ℃、4 h诱导的细胞裂解物；2. 纯化后的rTFNCPAm4M: Protein Marker; 1: The cell lysates of pET induced with IPTG for 4 h at 37 ℃; 2: rTFNCPAm4 after purification图4 与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清反应的Western blot鉴定Fig 4 The identification of rTFNCPAm4 with antitoxin serum of Clostridium perfringens type A by Western blot

1. 10倍浓缩的A型产气荚膜梭菌毒素；2. A型产气荚膜梭菌毒素；3.肉肝胃酶消化汤；4. 纯化后的rTFNCPAm41. Clostridium perfringens type A toxin 10-fold concentrated; 2. Clostridium perfringens type A toxin;3. anaerobic beef, liver and stomach digestive enzyme soup; 4. rTFNCPAm4 after purification图5 重组蛋白的卵磷脂酶活性鉴定Fig 5 The identification of phosphlipase C of rTFNCPAm4

1-6. 101～106倍稀释的A型产气荚膜梭菌毒素；7.肉肝胃酶消化汤；8. 纯化后的rTFNCPAm4；9. 蛋白溶解液；10. dd H2O1-6. Clostridium perfringens type A toxin with dilution of 101～106; 7. anaerobic beef, liver and stomach digestive enzyme soup;8. rTFNCPAm4 after purification; 9. elution buffer; 10. dd H2O图6 重组蛋白的溶血活性鉴定Fig 6 The identification of lysing red blood cells activity of rTFNCPAm4

表1 样品的注射以及小鼠存活情况Tab 1 Injection of sample and the mouse survival

2.5 rTFNCPAm4的免疫原性分析

2.5.1 抗rTFNCPAm4兔血清的中和抗体效价测定

经血清中和法测定，以rTFNCPAm4免疫兔子后，1毫升的一免抗血清可中和10个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素；1毫升的二免抗血清可中和40个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素，而佐剂对照组的兔血清对A型产气荚膜梭菌毒素无中和作用。

2.5.2 攻毒保护性试验 在二免21 d后，对所有rTFNCPAm4免疫组和佐剂免疫对照组的家兔，经耳缘静脉注射1个MLD剂量的A型产气荚膜梭菌毒素，结果佐剂免疫对照组家兔在攻毒后5 d内全部死亡(4/4)，rTFNCPAm4免疫组家兔全部健活，未见任何不良反应。

3 讨 论

基因工程亚单位疫苗研制的关键是免疫原的研究与筛选。与产气荚膜梭菌的其他3种主要致死性外毒素(CPB、ETX 及CPI)不同，天然的CPA经过通过甲醛灭活后，其抗原性会明显降低[18-19]，而未经突变的重组CPA仍存在一定的毒力，不适合直接用于疫苗制备[20]。为此，实现CPA的减毒乃至无毒，成为众多学者的研究方向。CPA分子主要由N末端(1-246)和C末端(247-370)构成。其中，具有细胞毒性的N末端是CPA的酶活性中心，而无细胞毒性的C末端主要发挥着与细胞受体相结合的功能[10]。虽然单独的C末端具有一定的免疫保护作用，但由于分子量较小，该部分需要与GST标签蛋白[21-22]或其他毒素蛋白[23-24]融合表达，从而造成实际抗原量降低，且难以对C末端的免疫保护性进行准确定量。此外，针对CPA第193-198位氨基酸片段的单抗在体外和体内实验中均被证实有很好的免疫保护作用[25]，这说明完整的CPA分子能够更加充分地发挥免疫保护作用。据报道，通过对CPA关键氨基酸位点进行点突变能够实现对CPA的减毒乃至无毒[11,26-27]。然而，此类研究仅仅进行了单氨基酸位点的突变，且没有对突变后的CPA进行抗原性分析。为此，选择该毒素N末端酶活性中心的Zn2+结合位点[11](第56位和第130位氨基酸)以及C末端与Ca2+结合的主要位点(第275和第336位氨基酸)同时进行突变，从而降低了因单个氨基酸突变在未来基因工程疫苗大规模生产中可能造成的生物安全隐患。

结果表明，在15 ℃和37 ℃条件下诱导，经灰度扫描测定，rTFNCPAm4可溶性表达比例均低于1%，且表达量无明显差异。综合考虑蛋白表达量和诱导时间，实验最终选择37 ℃进行诱导。实验结果证明，以非可溶形式表达的rTFNCPAm4经纯化复性后具有较好的免疫原性。此外，与可溶性表达的蛋白纯化过程相比，对以非可溶形式表达的重组蛋白进行纯化，可显著降低纯化产物中内毒素的含量，更适用于大规模兽用疫苗的制备。进一步的实验表明，rTFNCPAm4在检测范围内无卵磷脂酶和溶血酶活性且5.5 mg/kg剂量的rTFNCPAm4对小鼠仍无致死性，说明rTFNCPAm4已成功减毒。更重要的是，rTFNCPAm4具有良好的免疫原性，是A型产气荚膜梭菌及其它梭菌类毒素联苗的基因工程亚单位疫苗的重要候选抗原。然而，在前期的研究中我们发现可溶性重组ETX免疫原性明显高于非可溶性的重组蛋白。因此，如何提高rTFNCPAm4的可溶性表达水平，将是后续研究的重点。