郑 强， 杨远征， 陈志林， 郑盼盼， 陈佩莹， 孙广晓， 刘建莉

(海南医学院第一附属医院 1全科医学科， 2重症医学科， 3创伤与空难救援研究重点实验室， 海南 海口 570102)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstuctive pulmonary disease，COPD)是一种严重危害人类健康的常见病，其发病率和死亡率较高，已成为一个造成严重经济负担的公共卫生问题[1]。世界卫生组织的研究表明，COPD的死亡率居全球致死性疾病的第5位[2]。COPD在我国40岁以上人群的发病率较高，其中吸烟是诱发COPD最主要的危险因素[3]。COPD主要的病理变化是肺气肿，主要表现为肺组织弹性降低，终末细支气管远端过度膨胀、充气和肺容积增大或同时伴有气道壁破坏。肺气肿的主要发病机制包括细胞凋亡、蛋白酶与抗蛋白酶平衡的破坏、炎症反应和氧化应激反应[4]。内皮素-1(endothelin-1, ET-1)是一种由内皮细胞释放的具有强烈收缩血管和支气管的21肽，其作用具有持久性。肺是内皮素作用的主要靶器官以及合成、代谢的场所。研究表明内皮素-1与COPD的发生、发展具有密切关系[5]。本研究通过检测内皮素-1在吸烟者和COPD患者诱导痰中的表达量，以及通过构建肺气肿大鼠模型并采用内皮素A受体拮抗剂进行干预，探究内皮素-1在COPD发生发展中的作用以及机制。

材 料 和 方 法

1 实验材料和主要仪器

20只雄性SD大鼠购自Yison Bio。内皮素-1检测试剂盒购自上海研生生化试剂有限公司；内皮素A受体拮抗剂BQ123购自Peptides International Inc.；内皮素受体非选择性拮抗剂波生坦(bosentan,Bos)购自Actelion Pharmaceuticals;BCA蛋白浓度检测试剂盒购自Thermo Fish Scientific;抗cleaved caspase-3单克隆抗体购自Cell Signaling Technology;抗GAPDH单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的 II 抗、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)检测试剂盒和白细胞介素1β(interleukin-1β, IL-1β)检测试剂盒购自江苏碧云天生物技术研究所；明胶酶谱法所用缓冲液均为本实验室保存；生物抗氧化能力(bioantioxidant power，BAP)检测试剂盒购自Diacron International。光学显微镜购自Olympus；电泳仪购自Invitrogen；酶标仪购自Bio-Rad。

2 研究对象

收集健康不吸烟者(30例)、健康吸烟者(30例)和COPD患者(29例)，相应设为健康对照(healthy control)组、吸烟(smoking)组和COPD组。健康对照组平均年龄为(45.26±5.29)岁，无长期吸烟以及被动吸烟史；吸烟组平均年龄为(48.31±6.74)岁，吸烟史均超过10年；COPD组平均年龄为(53.80±9.26)岁，根据2007年《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》的诊断标准确认患者，并无哮喘病史和其它肺部疾病，处于COPD的稳定期。健康对照组和吸烟组患者均为2个月无呼吸系统疾病史，且均经询问、胸部X线、肺通气功能检查，确认无其它异常。根据参考文献[6]的指示，实验前15 min以雾化的形式吸入200 μg沙丁胺醇和7 mL 3%盐水，待有痰时将其收集入干净的培养皿中，置于4 ℃冰箱中保存。根据内皮素-1检测试剂盒说明书的指示进行操作，检测诱导痰中内皮素-1的浓度。

3 方法

3.1肺气肿模型的制备 根据参考文献[7]制备肺气肿大鼠模型。SD大鼠饲养在温度约为20～25 ℃的室内，保持良好的通风，自由采食和饮水。采用内皮素A受体拮抗剂BQ123和非选择性拮抗剂Bos进行干预，SD大鼠随机分为4组：对照(control)组、香烟烟雾干预(cigarette intervented)组、选择性内皮素受体拮抗剂(antagonist)组和非选择性内皮素受体拮抗剂(non-selective antagonist)组。对照组为常规饲养的大鼠，香烟烟雾干预组、选择性内皮素受体拮抗剂组和非选择性内皮素受体拮抗剂组腹腔内注射香烟烟雾提取物(红塔山香烟由抽吸装置连续抽吸注入PBS缓冲液)，每周注射 1 次，连续干预3周，成功建立大鼠肺气肿模型；选择性内皮素受体拮抗剂组采用腹腔内注射BQ123 (1 mg·kg-1·d-1)，每天注射1次，连续干预3周；非选择性内皮素受体拮抗剂组采用灌胃给药Bos (100 mg·kg-1·d-1)。

3.2样本的采集 于实验开始后的第21天，以腹腔注射戊巴比妥钠的方法麻醉大鼠，抽取5 mL下腔静脉血，4 ℃、3 000 r/min离心15 min，吸取上清，保存于-80 ℃冰箱中备用。结扎支气管，快速切取肺组织，预冷的生理盐水洗净后，加入细胞裂解液溶解肺组织，制成组织匀浆，10 000 r/min离心10 min，吸取上清即提取的蛋白质样品，保存于-80 ℃冰箱中备用。

3.3Western blot检测肺组织中cleaved caspase-3的蛋白水平 吸取3.2中提取的蛋白质，采用BCA法检测蛋白浓度，加入1倍体积的2×SDS缓冲液稀释蛋白质样品，100 ℃煮至蛋白质完全变性。采用1×SDS电泳缓冲液冲洗提前配制好的14%的SDS-PAGE上样孔。将玻璃板固定于电泳槽的缓冲室中，加入1×SDS电泳液，吸取40 μg蛋白质样品加入样品孔，120 V电压电泳1.5 h，直至溴酚蓝达到凝胶底部。切除多余凝胶，做好标记。组装转膜装置：负极-海绵-滤纸-凝胶-偏聚氟乙烯膜-滤纸-海绵-正极，加入转移缓冲液，接入电源，25 V电转移2 h。将携带目的蛋白的偏聚氟乙烯膜置于5%封闭液中，室温封闭1 h；加入封闭液稀释的Ⅰ抗，4 ℃过夜孵育。TBST洗涤6次，每次10 min,加入封闭液稀释的辣根过氧化物酶标记Ⅱ抗，室温，摇床上孵育1 h，Tris-HCl缓冲盐溶液+Tween(TBST)洗涤6次，每次10 min,加入增强化学发光(enhanced chemiluminescence, ECL)化学试剂盒A、B液进行反应，使用Quantity One 1-D Analysis Software 获得凝胶成像并分析其灰度值。

3.4检测肺组织中基质金属蛋白酶2(matrix metalloprotease，MMP-2)和基质金属蛋白酶9(matrix metalloprotease，MMP-9)的活性 采用明胶酶谱法检测肺组织中MMP-2和MMP-9的活性。将配置好的10%SDS-PAGE(含0.1%明胶)置于电泳装置中，加入1×SDS电泳缓冲液冲洗加样孔，将携带凝胶电泳的玻璃板置于缓冲液室中，加入1×SDS电泳缓冲液并淹没加样孔，取40 μg蛋白质样品加入上样孔，125 V恒定电压电泳1.5 h，直至蓝色条带迁移至凝胶底部。将凝胶置于洗脱液中振荡洗脱2次，每次30 min,然后置于漂洗液中漂洗每次20 min，洗2次，置于孵育液中37 ℃孵育过夜，考马斯亮蓝将凝胶染色3 h，加入脱色液A、B、C分别脱色0.5 h、1 h和2 h，蓝色背景上的透明条带即为MMP-2 (72 kD)和MMP-9 (92 kD)，凝胶成像系统分析其面积、宽度、灰度值。

3.5ELISA法检测肺组织匀浆离心上清液中TNF-α和IL-1β的浓度 严格根据其ELISA检测试剂盒说明书的指示进行操作。

3.6检测血清抗氧化能力 根据BAP检测试剂盒说明书的指示检测大鼠血清抗氧化能力。

4 统计学处理

数据用SPSS 22.0统计软件进行统计分析，实验结果以均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间差异行Bonferroni校正的t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 诱导痰中内皮素-1的浓度

吸烟组和COPD组诱导痰中内皮素-1的浓度较健康对照组显著增加(P<0.05);与吸烟组相比，COPD组诱导痰中内皮素-1的浓度显著增高(P<0.05)，表明内皮素-1参与COPD的发生发展,见图1。

Figure 1. The concentration of endothelin-1 in induced sputum. Mean±SD.*P<0.05vshealthy control group;#P<0.05vssmoking group.

图1诱导痰中内皮素-1的浓度

2 各组大鼠肺组织中MMP-2和MMP-9活性及cleaved caspase-3蛋白水平的检测

如表1所示，香烟干预组大鼠肺组织中MMP-2和MMP-9的活性较对照组显著增加(P<0.05)，选择性内皮素受体拮抗剂组和非选择性内皮素受体拮抗剂组中MMP-2和MMP-9活性较香烟干预组显著降低(P<0.05)；选择性内皮素受体拮抗剂组和非选择性内皮素受体拮抗剂组间MMP-2和MMP-9活性差异不具有统计学显著性。

香烟干预组大鼠肺组织中cleaved caspase-3蛋白的表达量较对照组明显增多(P<0.05);选择性内皮素受体拮抗剂组和非选择性内皮素受体拮抗剂组cleaved caspase-3蛋白的表达较香烟干预组明显降低(P<0.05)，见图2、表1。

Figure 2. The protein level of cleaved caspase-3 in the lung tissues of the rats determined by Western blot.

图2Westernblot检测大鼠肺组织中cleavedcaspase-3的蛋白水平

3 大鼠肺组织匀浆上清液中TNF-α和IL-1β的浓度比较

如表2所示，香烟干预组大鼠肺组织匀浆上清液中TNF-α和IL-1β的浓度较对照组显著增加(P<0.05);选择性内皮素受体拮抗剂组和非选择性内皮素受体拮抗剂组TNF-α和IL-1β的浓度较香烟干预组显著减少(P<0.05)；选择性内皮素受体拮抗剂组和非选择性内皮素受体拮抗剂组间TNF-α和IL-1β浓度的差异无统计学显著性。

表1大鼠肺组织中MMP-2、MMP-9活性和cleavedcaspase-3蛋白水平的检测

Table 1. The activity of MMP-2/MMP-9 and the protein level of cleaved caspase-3 in the lung tissues of the rats (Mean±SD.n=5)

GroupMMP-2MMP-9Cleaved caspase-3Control0.986±0.0850.962±0.0910.965±0.083Cigarette intervented1.952±0.257∗1.853±0.263∗2.457±0.486∗Antagonist1.124±0.226#0.983±0.089#1.014±0.377#Non-selective antagonist0.953±0.096#0.876±0.092#0.985±0.089#

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vscigarette intervented group.

4 大鼠血清抗氧化能力的比较

如表2所示，香烟干预组大鼠血清BAP较对照组显著降低(P<0.05)，选择性内皮素受体拮抗剂组和非选择性内皮素受体拮抗剂组大鼠血清BAP较香烟干预组显著增加(P<0.05)；选择性内皮素受体拮抗剂组和非选择性内皮素受体拮抗剂组间大鼠血清BAP的差异无统计学显著性。

表2大鼠肺组织匀浆上清液中TNF-α和IL-1β浓度及血清抗氧化能力的比较

Table 2. The concentrations of TNF-α and IL-1β in rat lung tissue supernatant and the serum level of bioantioxidant power (BAP) (Mean±SD.n=5)

GroupTNF-α (ng/g)IL-1β (ng/g)BAP (μmol/L)Control9.268±1.126125.323±32.7452 351.14±325.69Cigarette intervented14.587±2.365∗263.187±43.856∗1 238.54±276.28∗Antagonist9.560±1.252#135.685±37.368#2 598.47±396.60#Non-selective antagonist 8.963±1.032#123.585±40.223#2 235.24±342.37#

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vscigarette intervented group.

讨 论

COPD是一种不完全可逆的气流受限为特征的肺部疾病，气流受限通常呈进行性发展,并与肺对香烟烟雾等有害颗粒或气体的异常炎症反应有关[8]。COPD是一种可以预防和治疗的慢性气道炎症性疾病，吸烟被认为是主要的诱导因素之一。内皮素-1是目前作用效果最强和持久的血管收缩剂，同时具有促细胞分裂的功能。内皮素-1主要通过特异性受体参与血管收缩、成纤维细胞分裂、炎症反应过程，从而发挥其生物学作用[9-11]。内皮素-1受体作用范围较广，分为A受体和B受体。内皮素-1A受体分布于平滑肌细胞中，调控血管收缩过程；B受体多分布于内皮和平滑肌细胞中，调控血管舒张过程。内皮素-1促进或者抑制细胞凋亡的作用主要取决于细胞的种类和特异性表达A受体/B受体的多少[12]。研究表明，内皮素-1广泛参与呼吸系统疾病的发病机制，具有重要的生理功能[13]。有文献报道表明，小肺内动脉暴露于烟雾中可使内皮素-1的表达量增加[14]。在本文的研究中发现，内皮素-1在吸烟者和COPD患者中的表达量显著高于健康对照组，但内皮素-1在COPD患者中的表达量高于吸烟者，表明内皮素-1在COPD的发生发展过程中起重要作用，但其具体作用机制并不清楚。

阻塞性肺气肿简称为肺气肿，是COPD的主要病理变化，同时也是研究COPD发病机制的热点之一。细胞凋亡、炎症反应、蛋白酶失衡、氧化应激在肺组织保持完整结构的过程中起着重要作用，与肺气肿和COPD的发生发展密切相关[15-17]。Caspase蛋白家族成员介导的蛋白酶级联反应对细胞凋亡过程起着重要作用。Caspase-3是其级联反应的关键因子，在细胞凋亡过程中执行关键作用。基质金属蛋白酶通过降解细胞外基质和基底膜，在肺气肿的发生过程中发挥关键作用，与COPD的形成有关。研究表明，肺气肿患者的诱导痰中MMP-2和MMP-9的活性明显增加[18]。既往研究表明，许多淋巴细胞和炎症因子参与COPD的形成过程，破坏气道壁和肺组织的完整性，从而诱导肺气肿的产生[19]。研究表明，炎症介质比如TNF-α和IL-1β能够促进COPD气道炎症反应从而诱导气道重塑[20]。为了探究内皮素-1在COPD中的具体作用，本研究通过构建肺气肿大鼠模型，结果显示，香烟烟雾提取物可使大鼠肺组织中cleaved caspase-3蛋白水平、MMP-2和MMP-9的活性、上清液TNF-α和IL-1β的含量显著增加；内皮素A受体选择性和非选择性拮抗剂均能显著抑制肺组织中cleaved caspase-3蛋白水平、MMP-2和MMP-9的活性、上清液TNF-α和IL-1β的含量；香烟烟雾提取物抑制大鼠抗氧化能力，内皮素A受体选择性和非选择性拮抗剂均能促进大鼠抗氧化能力。这些结果提示内皮素-1可能通过调节细胞凋亡、基质金属蛋白酶活性、炎症以及氧化应激反应参与COPD发生、发展过程。

总之，内皮素-1在COPD患者中的表达量上调，可能通过调控细胞凋亡、基质金属蛋白酶动态平衡以及炎症、氧化应激过程参与肺气肿的病理机制，为内皮素-1受体拮抗剂用于缓解COPD的可能性提供了新的理论依据，但其具体的作用机制尚需进一步的研究。