周 晗， 梁若龙， 王晗月， 胡巢凤

(暨南大学基础医学院病理生理学系， 国家中医药管理局病理生理学实验室， 广东 广州 510632)

自噬是一个受自噬相关基因严密调控的复杂的动态过程，基础水平的自噬是维持细胞内稳态的必要条件，然而自噬失调会打破细胞原有的平衡状态，引发多种疾病的产生，如炎症、肿瘤和神经退行性疾病等[1-2]。营养缺乏、损伤、变性蛋白聚集和细胞器受损等应激情况可诱导自噬的发生，细胞中大量游离的单层或双层膜结构聚集，包绕在待降解物的周围，形成分隔膜，完全包绕待降解的细胞器、蛋白质形成双层膜的自噬体。细胞骨架微管系统将成熟的自噬体运输至溶酶体，二者融合形成自噬性溶酶体；自噬体内容物在溶酶体蛋白水解酶的作用下消化、降解，细胞吸收并重新利用这些降解产物。该过程中出现的自噬体是自噬发生的典型特征[3]。

受体相互作用蛋白(receptor-interacting protein，Rip)是一类重要的信号转导因子，通过与肿瘤坏死因子受体相互作用，介导下游核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信号通路, 诱导炎症反应和凋亡。Rip2属于Rip家族成员，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，位于胞浆，在抵抗多种病原体入侵机体的过程中发挥重要的作用[4]。我们前期的研究发现，Rip2能诱导人胰腺癌细胞株Panc-1凋亡[5]。Rip2是否能直接诱导自噬至今未见报道。因此，本实验主要研究过表达Rip2对Panc-1细胞自噬的影响及其作用机制，为胰腺癌治疗寻找新的靶点。

材 料 和 方 法

1 材料

Panc-1细胞由中山大学中山医学院惠赠。pEGFP-Rip2重组质粒由本课题组构建；胎牛血清及DMEM细胞培养基购自Gibco；转染试剂jetPRIME购自Polyplus；抗Rip2多克隆抗体购自Santa Cruz；抗微管相关蛋白1轻链3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)、beclin-1、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、p-mTOR、蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)、p-Akt和GAPDH抗体均购自CST。

2 方法

2.1Panc-1细胞培养及质粒转染 Panc-1细胞用10%胎牛血清的DMEM细胞培养基培养，同时加入1×105U/L 青霉素和 100 mg/L 链霉素，在37 ℃、5% CO2培养箱中进行细胞培养。以每孔3×105个细胞接种于6孔板中培养，第2天进行质粒转染。将Panc-1细胞分为对照(control)组：DMEM培养基培养细胞，未给予任何处理； pEGFP-C2空质粒(pEGFP-C2)组：转染pEGFP-C2空质粒6 h后，更换新鲜的DMEM培养基继续培养42 h；pEGFP-Rip2重组质粒(pEGFP-Rip2)组：转染pEGFP-Rip2重组质粒6 h后，更换新鲜的DMEM培养基继续培养42 h。

2.2Western blot检测蛋白表达 用含0.25% EDTA的胰酶消化细胞，收集Panc-1细胞，用预冷的PBS洗涤2次，向细胞沉淀加入RIPA裂解液100 μL和1 μL PMSF蛋白酶抑制剂，吹打混匀，置于冰上孵育30 min，4 ℃、12 000 r/min离心10 min, 收集上清, 并转移到EP中。提取蛋白后吸取少量蛋白提取液, 用BCA蛋白定量测定试剂盒进行蛋白浓度的测定。

用SDS-PAGE分离蛋白后，将蛋白转移至PVDF膜上，再置于封闭液中进行封闭1 h, 加Ⅰ抗体，4 ℃冰箱孵育12～16 h。滴加Ⅱ抗，TBST洗膜，曝光，用灰度分析软件对目的条带进行分析。

2.3透射电镜观察细胞内自噬体的数量 将细胞接种于6孔板培养，按照上面的分组对细胞进行基因转染。用细胞刮刀收集细胞样本，经过戊二醛-锇酸固定、梯度乙醇-丙酮脱水、浸透、Epon812包埋、高温聚合、修块、半薄切片、染色、定位、超薄切片和醋酸铀-柠檬酸铅染色等过程，将细胞样本制作成为超薄切片，置于透射电子显微镜下，观察细胞内自噬体的变化并拍照记录。

3 统计学处理

用SPSS 20.0软件对实验结果数据进行统计学分析。数据以均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间均数的两两比较采用Bonferroni检验。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

结 果

1 重组质粒转染前后Rip2蛋白的表达

pEGFP-C2空质粒和pEGFP-Rip2重组质粒分别转染Panc-1细胞48 h后，Western blot检测结果显示，与对照组和pEGFP-C2组相比，pEGFP-Rip2组细胞的Rip2蛋白表达明显增多(P<0.01)；而对照组与pEGFP-C2组相比，Rip2蛋白的表达差异无统计学意义,见图1。实验结果证明pEGFP-Rip2重组质粒成功转入细胞，并且上调细胞内Rip2蛋白的表达。

2 Rip2对自噬相关蛋白beclin-1和LC3-Ⅱ表达的影响

与对照组和pEGFP-C2组相比，pEGFP-Rip2组细胞的beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著升高(P<0.01)；而对照组和pEGFP-C2组比较，beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表达的差异无统计学意义，见图2。

Figure 1. The expression of the Rip2 protein in Panc-1cells with different treatments. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

图1各组Panc-1细胞Rip2蛋白的表达

3 透射电子显微镜观察各组细胞内自噬体的变化情况

pEGFP-C2空质粒和pEGFP-Rip2重组质粒分别转染Panc-1细胞48 h后，在透射电子显微镜下观察细胞内自噬体的变化情况。对照组、pEGFP-C2组和pEGFP-Rip2组的细胞内均可见自噬体，但对照组和pEGFP-C2组仅见少量自噬体，而pEGFP-Rip2组细胞内自噬体的数量明显增加,见图3。这一结果证明过表达Rip2可诱导Panc-1细胞发生自噬。

4 Rip2抑制磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/Akt/mTOR通路的活化

pEGFP-Rip2组细胞的p-Akt和p-mTOR蛋白水平明显低于对照组和pEGFP-C2组(均P<0.01)；而对照组和pEGFP-C2组相比，p-Akt和p-mTOR蛋白水平的差异无统计学显著性； 各组总Akt和mTOR蛋白的水平未见明显变化,见图4。这一结果说明Rip2可抑制PI3K/Akt/mTOR通路的活化。

Figure 2. The effect of Rip2 overexpression on the expression of beclin-1 and LC3-Ⅱ proteins in Panc-1 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

图2过表达Rip2对Panc-1细胞beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表达的影响

讨 论

自噬在肿瘤的发生发展过程中起着促进和抑制的双重作用，它既可以作为一种防御机制保护受损的细胞抵抗恶劣生存环境，促进细胞的生存，又可以在肿瘤细胞无法维持自身生存时诱导细胞自噬性死亡，对细胞产生杀伤性作用。自噬活性的变化与肿瘤发生、发展密切相关[6]。

大量文献报道Rip2与固有免疫、适应性免疫和炎症反应有密切关系，其中也有报道其与细胞凋亡和增殖有关[7]。那么，过表达Rip2是否对自噬有影响？Beclin-1是酵母自噬基因Atg6/Vps30在哺乳动物中的同源基因，它通过与激活PI3K形成复合物来调控其他自噬相关蛋白在自噬体膜上的定位和前自噬体的形成，是诱发细胞自噬的关键基因之一[8-9]。Beclin1基因是第一个确认的哺乳动物的自噬基因，也是第一个确认的在自噬溶酶体降解途径中起肿瘤抑制的基因，对自噬体的形成至关重要[10]。LC3是定位于自噬体膜上的标记蛋白，有 LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ 2种形式。LC3-Ⅱ始终稳定的存在于自噬体膜上，被当做自噬体的标记，并且LC3-Ⅱ的表达水平可以在一定程度上反映自噬体的数量[11]。我们通过Westernblot检测各组Panc-1细胞beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白的表达情况。结果显示pEGFP-Rip2组细胞的beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表达水平明显高于对照组和pEGFP-C2组，提示过表达Rip2可诱导Panc-1细胞发生自噬。

Figure 3. The changes of autophagosomes in Panc-1 cells under TEM (×8 900). A: control; B: pEGFP-C2; C: pEGFP-Rip2. M: mitochondrion; N: nucleus; arrow(→): autophagosomes

图3透射电子显微镜下观察Panc-1细胞内自噬体的变化情况

自噬体的形成是自噬过程中的关键步骤，因此，自噬的检测方法主要包括基于检测自噬体的直接(观察自噬体的数量及形态)和间接(检测自噬体的表面标记蛋白)方法。透射电子显微镜下观察到双层膜结构的自噬体是检测自噬的金标准，也是观察细胞自噬最直接、最经典的方法。因此，为了进一步验证过表达Rip2对Panc-1细胞自噬水平的影响，我们收集各组细胞并制作成超薄切片，在透射电镜下观察细胞内自噬体的变化情况。结果显示对照组、pEGFP-C2组和pEGFP-Rip2组的细胞内均有自噬体形成，但pEGFP-Rip2组细胞内自噬体的数量明显多于对照组和pEGFP-C2组。因此证明过表达Rip2可直接诱导Panc-1细胞发生自噬。

细胞自噬的调控涉及多种复杂的信号通路，其中PI3K/Akt/mTOR信号通路在调控细胞自噬活性中发挥关键作用。mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，受营养状况、生长因子和ATP等多种因素变化的影响，可使其下游靶蛋白发生磷酸化，调节基因转录、蛋白表达和调控自噬。研究发现，生长因子等通过受体酪氨酸激酶活化Ⅰ型PI3K，催化磷脂酰肌醇4,5-二磷酸转化为磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate，PIP3)， PIP3与细胞内含有PH结构域的信号蛋白Akt和磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1 (phosphoinositide-dependent kinase-1，PDK-1)结合, 促使PDK1磷酸化Akt导致Akt活化，从而激活mTOR, 抑制自噬[12-13]。

Figure 4. The effect of Rip2 overexpression on the levels of p-Akt and p-mTOR proteins in Panc-1 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

图4过表达Rip2对Panc-1细胞p-Akt和p-mTOR蛋白表达水平的影响

为了探究Rip2诱导自噬是否与PI3K/Akt/mTOR通路相关，我们应用Western blot检测各组细胞内p-Akt蛋白的水平。结果显示pEGFP-Rip2组细胞的p-Akt蛋白水平明显低于对照组和pEGFP-C2组，而各组总Akt蛋白表达未见明显变化。随后，我们又检测了Akt下游p-mTOR蛋白水平的变化，发现pEGFP-Rip2组细胞p-mTOR的蛋白水平明显低于对照组和pEGFP-C2组，而各组总mTOR蛋白水平无明显变化。以上结果说明过表达Rip2可诱导Panc-1细胞发生自噬，其机制可能与抑制PI3K/Akt/mTOR通路的活化有关。

综上所述，Rip2能够诱导Panc-1细胞发生自噬；其作用机制可能与Rip2下调磷酸化Akt和mTOR的蛋白水平，进而抑制PI3K/Akt/mTOR通路的活化有关。随着进一步探讨Rip2诱导自噬的作用机制，将为临床治疗胰腺癌及其他肿瘤寻找新的靶点提供实验依据。