苏珊珊， 宫 雪， 张吉生， 包名家， 王 勇， 李慧玲， 张晓丽

近年来，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）在全世界范围内广泛流行，以耐药性强、致死率高、具有传播性且难以治疗为特点，引起人们的广泛关注。了解其耐药及毒力的分子机制，对于控制CRKP的传播至关重要。本文研究佳木斯大学附属第一医院入住重症监护室（ICU）患者CRKP的耐药机制、同源性及序列分型，以期为临床抗感染治疗和隔离预防提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源及鉴定药敏

收集我院2016年4－12月分离自ICU的CRKP 16株，剔除同一患者的重复菌株，实验前重新鉴定。其中14株分离自痰液，2株分离自血液。药敏试验质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922。VITEK 2-Compact全自动微生物分析仪及配套的药敏卡（GN和GN13）进行菌株鉴定及药敏分析。采用亚胺培南、美罗培南、厄他培南、阿米卡星、环丙沙星和左氧氟沙星纸片进行纸片扩散法对CRKP药敏进行结果的复核，选取对亚胺培南、美罗培南或厄他培南至少一种药物耐药者，参照CLSI 2016年M100-s26版进行药敏结果判读。纸片购自英国OXIOD公司。

1.2 表型鉴定

改良Hodge试验（MHT）[1]，根据CLSI指南要求进行试验并对结果进行判读；改良碳青霉烯灭活试验（mCIM）[1]，根据CLSI指南要求进行操作，当菌悬液浸泡过的美罗培南纸片抑菌圈直径为6～15 mm或抑菌圈内有散在菌落但直径为16～18 mm，即为mCIM试验阳性。

表1 PCR引物序列Table 1 The primers and corresponding sequence used in PCR

1.3 耐药基因、血清型及毒力基因检测及测序

采用聚合酶链反应（PCR）法检测耐药基因。煮沸法提取菌株DNA。检测的耐药基因包括碳青霉烯酶：blaKPC、blaNDM、blaIMP-1、blaIMP-8、blaVIM-1、blaVIM-2、blaOXA-48； ESBL耐药基因：blaSHV、blaTEM、blaCTX-M-1、blaCTX-M-9；AmpC酶：blaDHA；血清型基因：K1、K2、K5、K20、K54、K57；毒力基因：magA、rmpA、uge、wcaG、aero、allS、mrkD、kpn、fimH、iroNB，引物序列见表1[2-10]，上海生工生物公司合成。总反应体系25 μL：Go Taq Master Mix 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，细菌模板DNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。扩增条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共循环30次，72 ℃延伸10 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳，扩增产物送哈尔滨博仕生物公司双向测

序，测序结果在BLAST上比对确定基因型。

表1 （续）Table 1（continued）

1.4 同源性分析

采用肠杆菌科基因间重复一致序列PCR（ERIC-PCR）进行同源性分析，引物序列为ERIC-2：5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3'，反应条件及反应体系参照文献合成[4]，扩增产物后用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，并用紫外凝胶成像系统进行拍照分析，只要条带数目及位置完全相同计为同一型。

1.5 多位点序列分型（MLST）

选取肺炎克雷伯菌的7个管家基因gapA、mdh、pgi、infB、rpoB、tonB、phoE进行扩增，引物设计和反应条件参照http：//www.pasteur.fr/公布的数据。扩增产物送哈尔滨博仕生物公司测序，结果上传至数据库http://bigsdb.pasteur.fr进行比对分型。

2 结果

2.1 ICU患者入院情况

患者年龄层次偏大，大于50岁的占81.3%，患者有较重的心脑血管疾病或腹部损伤及细菌感染，入院天数较长，平均入院时间27.3 d，均有长期应用多种抗菌药物史，病死率50.0%，见图1。

图1 ICU患者流行病学分析Figure 1 Epidemiological analysis of ICU patients

2.2 药物敏感试验结果

16株CRKP对氨苄西林、氨苄西林-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦、头孢唑林、头孢他啶、头孢曲松、氨曲南、亚胺培南、厄他培南、美罗培南、庆大霉素、妥布霉素均耐药，对阿米卡星、左氧氟沙星保持较高的敏感率，见表2。

表2 16株CRKP对抗菌药物的药敏结果Table 2 Antimicrobial susceptibility of the 16 strains of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae

2.3 碳青霉烯酶表型检测结果

16株CRKP改良Hodge试验均为阳性，15株CRKP mCIM阳性。

2.4 耐药基因及毒力基因检测结果

16株CRKP主要携带碳青霉烯酶及超广谱β内酰胺酶（ESBL）基因，其中A类碳青霉烯酶KPC-2、CTX-M-1、SHV占100%，15株产TEM（93.8%），1株产B类金属酶NDM-5（6.3%）。16株CRKP菌株血清型均为阴性，但携带mrkD、fimH、kpn、uge毒力基因，阳性率均为100%。本次实验并未检出IMP-4、IMP-8、VIM-1、VIM-2、ACC、OXA-48、CTX-M-9、DHA、K1、K2、K5、K20、K54、K57、magA、rmpA、wcaG、aero、alls、iroNB基因，见表3。阳性基因见图2。

2.5 同源性分析和分型

ERIC-PCR同源性分析结果：16株CRKP均含有相同的DNA指纹图谱，为A型（图3）。MLST分型结果：通过对肺炎克雷伯菌7个管家基因进行分析，16株CRKP均为ST76型。见图3。

3 讨论

我院ICU从2016年4－12月，共检出16株CRKP，且均为ST76型，ERIC为同一型别，说明有小范围流行。肺炎克雷伯菌ST76型很少报道，曾见于上海及南昌[11-12]， 不同于国内主要流行株ST11型。上海市儿童医院在2016年的一次暴发流行中分离出ST76型CRKP，并未导致患者死亡，而我院感染ST76型CRKP患者病死率达到50.0% ，高病死率可能与患者严重的基础疾病和并发症密切相关[13]。16例ICU患者有较重的心脑血管疾病、外伤及严重感染，在住院期间曾有青霉素类、头孢菌素类、β内酰胺酶抑制剂、喹诺酮类等抗菌药物治疗史，其中6例患者也曾用过碳青霉烯类药 物。

抗菌药物敏感试验显示仅对阿米卡星、左氧氟沙星保持较高的敏感率，对其余抗菌药物耐药率较高，与深圳的一篇报道相似[14]。16株菌携带KPC-2基因，1株携带NDM-5基因，全部菌株都含有3种及以上耐药基因型，有研究指出碳青霉烯酶和ESBL基因可以通过质粒接合进行转移[5，11]，可见CRKP的多重耐药是多基因共同作用的结果，并通过质粒在医院环境中水平传播，与其他报道一致[15]，使得临床治疗变得更加困难。

表3 CRKP耐药基因携带情况Table 3 Resistance genes carried by carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae strains

图2 耐药基因阳性电泳图Figure 2 Electrophoretogram of the resistance genes identified from carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae strains

图3 部分CRKP的ERIC-PCR电泳图Figure 3 Electrophoretogram of ERIC-PCR products amplified from carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae strains

2007年，我国发现首例产KPC-2型肺炎克雷伯菌，随后在北京、天津、上海、江苏、浙江、甘肃迅速播散[16]。KPC基因是肠杆菌中检出率最高的碳青霉烯酶， 携带KPC基因的CRKP已经成为患者死亡的独立危险因素[17]。本实验检出16株CRKP均为产KPC-2酶的菌株，推断本次流行为携带KPC-2基因的菌株引起病房内广泛传播。2010年有杂志报道了1株携带新德里1型（NDM-1）的“超级细菌”[18]，引起人们广泛关注，随后许多国家相继报道，2013年我国报道了第1例携带NDM-1基因的CRKP[11]。NDM-5是NDM酶的一个亚型，有报道显示其对碳青霉烯类抗生素的耐药性比NDM-1更强[19]。NDM-5基因易存在于大肠埃希菌，在肺炎克雷伯菌中表达的报道很少[20]。本次实验发现1株产NDM-5酶的CRKP，有厄他培南药物应用史。有报道显示ST76型仅在产KPC酶菌株中存在[21]，国内报道的ST76型CRKP为携带NDM-1和NDM-5基因[11-12]，而我们分离的菌株主要携带KPC-2基因，同时发现1株携带KPC-2和NDM-5基因，是否存在2种耐药质粒，我们将进行更深层次的研究。

有研究指出黏液表型编码基因（rmpA）和需氧菌素基因（aero）阳性可认为是高毒力肺炎克雷伯菌，比拉丝试验准确率更高[22]，本研究这两个基因均为阴性，提示目前我院ST76型CRKP不具备高毒力特征。至今肺炎克雷伯菌至少已有78种血清型，其中K1、K2被认为是重要的毒力血清型[23]，本实验6个常见血清型均为阴性，不排除有其他血清型存在的可能。我们的结果中mrkD、fimH、kpn检出率100%，fimH-1主要编码I型菌毛黏附基因，mrkD主要编码III型菌毛黏附基因，kpn类似fi mH-1的黏菌素基因，均与细菌黏附相关，使菌体易黏附在呼吸道、泌尿道上皮增加感染的机会，多药耐药的肺炎克雷伯菌存在高黏附特性，给治疗带来挑战，也可能是本研究死亡率高导致治疗失败的主要原因之一。

综上，我院ICU分离出ST76型CRKP，主要携带KPC-2基因，并出现小范围流行。应加强对ICU的监测，发现耐药菌株尽快隔离，加强医护人员手部卫生及对耐药菌处理的相关知识，控制耐药菌的水平传播，加强抗菌药物管理、CRKP筛查和定期监测，减少医院感染的发生。