张继斌

（劲牌生物医药有限公司，中药保健食品质量与安全湖北省重点实验室，湖北大冶 435100）

砂仁为姜科植物阳春砂（Amomum villosum Lo-ur.）、绿壳砂（Amomum villosum Lour.var.xanthioides T.L.Wu et Senjen） 或海南砂 （Amomum longiligularg T.L.wu）的干燥成熟果实，具有化湿开胃、温脾止泻、理气安胎等功能，主要用于湿浊中阻、脘痞不饥、脾胃虚寒、呕吐泄泻、妊娠恶阻、胎动不安等[1]。砂仁主要成分为挥发油类成分[2-4]，但其中也含有黄酮类成分[5]和多糖类成分[6]。

试验通过正交试验法优选药材粒度、溶剂倍数、浸泡时间、提取时间等影响因素，以提取得到挥发油中乙酸龙脑酯、提取物中总黄酮和总多糖提取率为考查指标，确定了砂仁药材综合利用的最佳工艺条件。通过对砂仁药材进行一次提取，同时得到砂仁挥发油、砂仁黄酮、砂仁多糖提取物，对砂仁药材进行了综合利用，具有显著的经济效益和社会效益。

1 试验材料

1.1 仪器与设备

6890型气相色谱仪，安捷伦科技公司产品；TU1901型紫外可见分光光度计，北京普析通用有限公司产品；AB135-S型电子天平，梅特勒-托利多公司产品；FA2004型电子天平，上海精密科学仪器有限公司产品；SK8200LHC型超声提取器，上海科导超声仪器有限公司产品。

1.2 材料与试剂

砂仁药材，由劲牌生物医药有限公司提供；乙酸龙脑酯对照品、芦丁对照品、葡萄糖对照品，由中国食品药品监督检定研究院提供；苯酚、浓硫酸、甲醇、乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠，均为分析纯；纯净水。

2 试验方法

2.1 乙酸龙脑酯含量测定

按《中国药典》2015版一部“砂仁”项下规定的方法测定。

2.2 总黄酮含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取5 mg芦丁标准品，用30%乙醇溶液溶解并定容至50 mL，作为对照品溶液。

2.2.2 标准曲线的制备

精密量取对照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，然后加入0.3 mL 5%NaNO2溶液，混匀，放置6 min；加入0.3 mL 10%AL（NO3）3溶液，混匀，放置6 min；然后加入1 mol/L的NaOH溶液2 mL，混匀，放置15 min；用30%乙醇定容至10 mL，摇匀。以相应试剂为空白，于波长510 nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、质量浓度为横坐标绘制标准曲线。

2.2.3 供试品溶液的制备

称取适量的提取物粉末样品，加入适量的50%乙醇至50 mL容量瓶中，摇匀，超声溶解，定容，放置，作为供试品溶液。

2.2.4 含量测定

精密吸取供试品溶液1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，按照2.2.2的方法，自“加入0.3 mL 5%NaNO2溶液”起，依法测定吸光度，计算即得。

2.3 总多糖含量测定

2.3.1 对照品溶液的制备

精确称取105℃干燥至恒质量的葡萄糖对照品50 mg，置于50 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度。再量取1 mL，置于50 mL容量瓶中，加水稀释至刻度。

2.3.2 标准曲线的制备

吸取葡萄糖标准液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，分别置于具塞比色管中，分别加水补至2.0 mL，分别精密加入5%苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速精密加入浓硫酸5 mL，摇匀，置沸水浴中煮沸15 min，取出冷却至室温，以相应试剂为空白，于波长490 nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、质量浓度为横坐标绘制标准曲线。

2.3.3 供试品溶液的制备

称取样品约15 mg，于50 mL容量瓶中，加入40 mL水，超声溶解、定容、过滤，作为供试品溶液备用。

2.3.4 显色测定

取上述供试品溶液1 mL，加水至2.0 mL，按照2.3.2的方法，自“精密加入5%苯酚溶液1 mL”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中葡萄糖的质量浓度，计算即得。

3 正交试验

3.1 因素水平设计

采用水加热提取，其影响因素主要有药材粒度、溶剂倍数、浸泡时间、提取时间[7]，采用L9（34）正交表优化提取条件，考查上述4个因素和3个水平。

因素与水平设计见表1。

表1 因素与水平设计

3.2 样品制备

将砂仁药材分别按要求称取质量为100 g的样品9份，按正交试验表的条件分别进行加热提取，收集得到挥发油，准确测量其体积。

挥发油相关数据见表2。

表2 挥发油相关数据

3.3 含量测定

按试验方法测定挥发油中的乙酸龙脑酯的含量，并分别计算质量。结果如表2所示。

3.4 正交分析

以挥发油中乙酸龙脑酯质量为考查指标，进行正交试验结果分析。

正交试验结果见表3。

表3 正交试验结果

从表3结果可以看出，以乙酸龙脑酯提取率为考查指标，极差结果表明，各因素的作用依次为样品粒度＞提取时间＞浸泡时间＞溶剂倍数，以样品粒度因素影响为最大。同时通过直观分析结果表明，以A3B3C1D3为最佳提取条件。但由于在实际生产过程中，药材粉碎难度较大，且粉碎后提取液难以过滤，因此样品的粒度选择“粉碎”。因此，砂仁药材的最佳提取条件确定为粉碎15倍，浸泡时间0.5 h，提取时间6.0 h。

4 纯化试验

4.1 提取

称取砂仁药材样品300 g，按正交试验最佳提取条件进行提取，将样品破碎，加入15 BV（4 500 mL）纯净水，浸泡0.5 h，加热回流提取6.0 h。

4.2 浓缩

将提取液趁热过滤，滤液浓缩至体积约300 mL（生药质量浓度1.0 g/mL）。

4.3 醇沉

将以上得到的浓缩液分为4份，每份样品75 mL，相当于原药材75 g。将其中3个浓缩液中分别加入不同体积的乙醇溶液，使醇沉分别达到60%，70%，80%，搅拌均匀，静置12 h。其中，1个浓缩液不醇沉，作为对比样品。

4.4 黄酮提取物

将醇沉液离心后的上清液回收乙醇，浓缩干燥，得到砂仁黄酮提取物。同时将未醇沉的浓缩液直接浓缩干燥，得到砂仁粗提取物，并按试验方法分别对提取物样品进行总黄酮含量测定。

砂仁黄酮提取物试验结果见表4。

表4 砂仁黄酮提取物试验结果

从表4试验结果可以看出，醇沉可有效提高提取物中总黄酮的含量，随着醇沉质量分数的不断提高，砂仁总黄酮提取物的得率和总黄酮成分的得率越来越低，提取物的含量越来越高。

4.5 多糖提取物

将醇沉液离心后的沉淀直接干燥粉碎，得到砂仁多糖提取物。同时，将未醇沉的浓缩液直接浓缩干燥，得到砂仁粗提取物，并分别按试验方法对提取物进行总多糖含量测定。

砂仁多糖提取物试验结果见表5。

表5 砂仁多糖提取物试验结果

从表5试验结果可以看出，随着醇沉质量分数的不断提高，砂仁总多糖提取物的得率越来越高，提取物的含量越来越低，但总多糖的得率以70%醇沉质量分数为最高。综合总黄酮和总多糖提取物的试验结果分析，砂仁粗提取物的纯化条件以醇沉质量分数70%为最适宜。

5 验证试验

5.1 试验条件

称取砂仁药材样品150 g共2份，将样品破碎，加入15 BV（2 250 mL） 纯净水，浸泡0.5 h，加热回流提取6.0 h，收集得到砂仁挥发油。将提取液过滤，浓缩至体积约150 mL（生药质量浓度1.0 g/mL）。浓缩液中分别加入乙醇溶液，使醇沉质量分数分别达到70%，搅拌均匀，静置。将醇沉液用离心机离心，分别取上清液和沉淀。将醇沉离心后的上清液分别回收乙醇，浓缩干燥，得到砂仁黄酮提取物。将醇沉离心后的沉淀干燥粉碎，得到砂仁多糖提取物。

5.2 提取物得率

计算挥发油、黄酮、多糖3种提取物的得率。各提取物的得率见表6。

表6 各提取物的得率

5.3 有效成分得率

按试验方法测定挥发油中乙酸龙脑酯的含量、提取物中总黄酮和总多糖的含量，分别计算各有效成分的得率。

各有效成分得率见表7。

表7 各有效成分得率

6 结论

（1）试验对砂仁药材进行加热提取，通过对水蒸气冷凝分层收集得到砂仁挥发油，同时对提取液浓缩后醇沉，分别干燥得到砂仁黄酮和多糖提取物，采用一种工艺同时得到砂仁的3种提取物，对砂仁药材进行了综合利用，有效降低了生产成本，实现了资源的合理利用，具有显著的经济效益和社会效益。

（2）通过提取正交试验和纯化试验，结合生产的实际情况，砂仁药材综合利用最佳试验条件为取砂仁药材破碎，加15倍量的水，浸泡0.5 h，提取6.0 h。提取液浓缩至生药质量浓度1.0 g/mL，醇沉质量分数达到70%。

（3）经过对砂仁药材综合利用最佳试验条件的验证，每100 g砂仁药材可得到砂仁挥发油2.5 mL，挥发油中乙酸龙脑酯的含量为469.7 mg/mL。同时可得到砂仁黄酮提取物6.04 g，提取物中总黄酮的含量为36.32%，得到砂仁总多糖提取物5.84 g，提取物中总多糖的含量为8.50%。