邬亭亭 刘平 郭术良 魏强 罗永艾

(1.成都市第三人民医院呼吸内科，四川 成都 610031；2.重庆医科大学附属第一医院呼吸与危重症医学科，重庆 400016；3.重庆市长寿区人民医院呼吸内科，重庆 401220；4.成都市天府新区人民医院内二科，四川 成都 610213)

我国是全球结核高负担国家之一。结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)耐药形势严峻。耐药结核病的流行严重威胁我国结核病的防治工作，已经成为我国结核防控关注重点。噬菌体是一种细菌依赖性病毒，可以裂解细菌，具备抗菌潜力。噬菌体治疗铜绿假单胞菌等耐药菌属获得成功[1，2]的报道提示，分枝杆菌噬菌体具备治疗耐药结核病的潜力，为耐药结核病治疗提供新思路。本文研究分枝杆菌噬菌体DNAⅢ的生物学特性和抗耐药MTB的作用，为抗耐药MTB噬菌体鸡尾酒疗法提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 ①噬菌体及其宿主菌 噬菌体TM4由美国匹兹堡大学Hutful教授惠赠；噬菌体DNAⅢ、Sedeg、Legendre、33D、BO4、Clark和Leo由加拿大Laval大学赠送；噬菌体D29和耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis ,MS) mc2155由中国药品生物制品检定所王国治教授赠送；分枝杆菌临床株由本课题组2010年5月～2011年4月期间从重庆医科大学附属第一医院结核病人痰中分离，比例法检测药敏；MTB H37Rv购于重庆市肺科医院。②主要试剂：OADC增菌液(美国sigma公司)，7H9/7H10培养基(美国BD公司)，福氏完全佐剂(美国sigma公司)，罗氏培养基(珠海贝索公司)。实验动物:新西兰大耳白兔(符合伦理要求)由重庆医科大学实验动物中心提供

1.2 方法

1.2.1 噬菌体的制备及噬菌斑观察 参照文献方法[3]，采用双层琼脂培养法制备噬菌体，次日观察噬菌斑。

1.2.2 透射电镜 根据λ噬菌体提取方法[4]，取20 uL纯化的噬菌体DNAⅢ液滴于铜网上，15min自然沉降后，加磷钨酸(20 g/L，pH7.0)10ul于铜网上染色10 min，透射电镜观察颗粒形态。

1.2.3 最佳感染复数(muitiplicity of infection，MOI)的测定 参照文献方法[5]，设置不加宿主菌的噬菌体和不加噬菌体的宿主菌为对照组，重复实验三次，每个MOI做两份取平均值。测定最小MOI(噬菌体感染宿主菌 24 h后全部MS被裂解的MOI)和最佳MOI(产生最高噬菌体滴度的MOI)。

1.2.4 一步生长曲线 参照文献方法[6]，设置对照组(①不加宿主菌的噬菌体;②不加噬菌体的宿主菌)，各时间点均作两份复管取平均值，重复实验三次。绘制噬菌体DNAⅢ一步生长曲线，根据裂解量计算公式计算DNAⅢ裂解量。

1.2.5 噬菌体理化稳定性实验 ①噬菌体的热稳定性检测实验：将滴度为1010pfu/mL的DNAⅢ噬菌体原液分别置于37℃、60℃、70℃恒温水浴箱中温浴1 h，15 min取样一次，立即冰浴至室温，测定噬菌体滴度。②噬菌体的pH稳定性检测实验：分别取4.5ml不同pH的7H9液加入试管中，置于25℃的恒温水浴箱中，温度恒定后加入0.5 mL的DNAⅢ原液，恒温1 h，测定噬菌体滴度。③不同pH值环境下噬菌体裂解能力实验：将10 uL DNAⅢ液加入到MS中(0.2 mL，对数生长期)，混匀后共孵育10min。制备pH为7.4和5的培养平板，双层平板培养法培养。

1.2.6 噬菌体宽噬实验 双层琼脂培养基上分别制成均匀的菌苔(宿主菌：分枝杆菌各临床分离株)。在菌苔上滴加1×109pfu/mL的DNAⅢ噬菌体液，37℃培养箱培养，6～8周后观察结果。

1.2.7 血清中和实验和交叉中和实验 ①DNAⅢ抗血清制备：按方法[5]制备抗血清。②血清中和实验：按照文献[7]方法，测定抗DNAⅢ血清K值。

式中D是抗血清稀释度，P为经t分钟后测定的噬菌体滴度，P0为未加抗血清时测定的噬菌体滴度，本实验中t=5。③血清交叉中和实验：按照文献[7]方法，8株噬菌体与DNAⅢ的抗血清进行交叉中和试验，根据上述公式计算K值。

2 结果

2.1 噬菌体DNAⅢ噬菌斑及噬菌体透射电镜

2.1.1 DNAⅢ噬菌斑形态：平均直径约为1 mm，圆形透明，见图1-A。

2.1.2 噬菌体透射电镜：由透射电镜(见图1-B)可见噬菌体DNAⅢ颗粒由一个长多面体立体对称的头部和尾部组成，头部直径(57±8.9 )nm，尾长(208±28.7 )nm。分枝杆菌噬菌体DNAⅢ为长尾噬菌体。

2.2 噬菌体DNAⅢ最佳MOI、最低MOI测定 DNAⅢ产生最多子代噬菌体的M0I为0.0001，为噬菌体DNAⅢ的最佳MOI；M0I分别为10、1、0.1、0.01和0.001时，共培养24 h后，所有宿主菌MS被裂解，DNAⅢ感染MS的最低MOI为0.001，见表1。

2.3 噬菌体DNAⅢ一步生长曲线 噬菌体DNAⅢ感染MS的潜伏期为165 min。根据裂解量计算公式计算噬菌体DNAⅢ感染MS的裂解量为28，见图2。

2.4 噬菌体理化稳定性实验

2.4.1 噬菌体DNAⅢ热稳定性实验：显示噬菌体DNAⅢ对热敏感，70℃恒温加热15min即可灭活全部DNAⅢ，见图3A。

图1 噬菌体DNAⅢ噬菌斑(A)及噬菌体DNAⅢ透射电镜图(B)Figure 1 Plaques produced of phage DNAⅢ (A) and electron micrograph of DNAⅢ (B)

图2 分枝杆菌噬菌体DNAⅢ的一步生长曲线Figure 2 One-step growth curve for phage DNAⅢ

2.4.2 噬菌体DNAⅢ pH稳定性实验：显示在酸碱环境明显影响DNAⅢ的存活率，pH12.0时和pH4.0时DNAⅢ的存活率均为0，见图3B。

2.4.3 不同pH值环境下噬菌体裂解能力实验：PH值为5的环境下依然有部分噬菌体能裂解宿主菌，据此推测DNAⅢ不仅能裂解体液中的宿主菌，还有可能裂解巨噬细胞中的宿主菌,见图4。

2.5 噬菌体DNAⅢ宽噬实验 实验证实DNAⅢ不能有效裂解耐药分枝杆菌临床分离株，对耐药结核分枝杆菌的裂解率达78.26%。噬菌体DNAⅢ是宽噬噬菌体，见表2。

图3 温度(A)、酸碱(B)对噬菌体DNAⅢ活力的影响Figure 3 Effects of temperature and pH on livability of phage DNAⅢ.

图4 pH值对噬菌体DNAⅢ裂解能力的影响Figure 4 Effects of pH on lysing of phage DNAⅢ

表2 噬菌体DNAⅢ裂解谱实验Table 2 Broad lysing experiment of phage DNAⅢ

注：XDR-TB：extensively drug resistant tuberculosis，泛耐药结核菌；MDR-TB：Multidrug-Resistant Tuberculosis，多重耐药结核菌。

2.6 血清中和实验及交叉中和实验 抗DNAⅢ血清稀释1000倍后仍能有效中和DNAⅢ对宿主菌的吸附与感染(K=770.01)，但只稀释10倍时才能中和Legendre, BO4和33D对宿主菌的吸附与感染；原液才能中和噬菌体Sedge和Leo对宿主菌的吸附与感染；DNAⅢ抗血清不能综合D29对宿主菌的吸附与感染，见表3。

表3噬菌体DNAⅢ抗血清中和实验和交叉中和实验

Table3NeutralizationtestandcrossneutralizationtestofphageDNAⅢ

噬菌体抗DNAⅢ 血清DP0PKLegendre10303493.64TM4100222480BO41015268 1.61Sedgeundiluted24460.7233D10217323.82Clark252961913.71Leoundiluted305210.53D29undiluted244210-DNAⅢ10002365770.01

注：D. 抗血清稀释度; P0. 未加抗血清时测定的噬菌体滴度; P. 经5 min后测定的噬菌体滴度

3 讨论

目前结核病的主要治疗方式为化疗。50年没有突破性的抗结核新药问世，结核药物研发严重滞后。面对庞大的结核病患病人数和死亡人数的严峻现实，急需开发新的抗结核治疗药物。

分枝杆菌噬菌体能够裂解结核分枝杆菌，有望用于耐药结核病的治疗[8]。作为目前研究最详细的分枝杆菌噬菌体，Ford等于1998年已完成D29的全基因组测序。国内已有几个研究团队将D29用于结核病的治疗[9-10]，同时发现MTB对D29耐药现象。细菌对噬菌体快速耐药变异，一直是噬菌体疗法难以推广的巨大阻碍[11]。国外已有研究成功利用噬菌体"鸡尾酒疗法"治疗其他细菌感染，噬菌体"鸡尾酒疗法"不仅能提高噬菌体杀菌疗效，还能延缓细菌对噬菌体产生耐药性[1,12-14]。综合之前的研究，本课题组提出分枝杆菌噬菌体"鸡尾酒疗法"抗耐药MTB的科学构想。通过从国外引进和自主分离多株分枝杆菌噬菌体，用于筛选"鸡尾酒疗法"的噬菌体配方。通过研究分枝杆菌噬菌体DNAⅢ基本生物学特征，筛选宿主谱宽，无交叉吸附表位的分枝杆菌噬菌体，为分枝杆菌噬菌体鸡尾酒疗法抗耐药MTB研究提供实验依据。

烈性噬菌体能在宿主菌体内迅速增殖并裂解细菌。噬菌体DNAⅢ的噬菌斑透明清晰，为烈性噬菌体的噬菌斑特征。Pedulla等的实验[15]和我们的前期实验[16]发现长尾噬菌体能杀灭休眠菌。这是因为长尾噬菌体的卷尺蛋白具有Motif 3基序，该基序能促进休眠菌复苏。因此我们有理由相信长尾噬菌体科噬菌体DNAⅢ也具备杀灭MTB休眠菌的潜力，为减少结核病复发提供新思路[17]。

通过最佳MOI的测定，本研究发现少量噬菌体DNAⅢ与宿主菌共培养即可提供噬菌体疗法所需的大量噬菌体。通过最低MOI的测定发现DNAⅢ对MS极度易感。

噬菌体DNAⅢ感染MS的潜伏期是165 min，同我们前期对分枝杆菌噬菌体LEO、chy1、BO4一步生长曲线类似[18-20]，较以往报道过碳青霉烯类鲍曼不动杆菌噬菌体[21]和鼠疫菌噬菌体[22]的生长周期长。分枝杆菌噬菌体潜伏期长，可能是因宿主菌增殖慢导致。张劼等研究者[21]认为噬菌体裂解量大的，能产生更多的子代，有更多的噬菌体侵染未裂解的细菌。PH值为7的环境最适合噬菌体DNAⅢ生存，因此DNAⅢ能在人体血液(PH值7.35-7.45)内存活、杀菌。人巨噬细胞溶酶体和内吞体的pH值约为5[23]，在该PH值环境中DNAⅢ仍具有杀菌能力，说明胞内菌有可能被DNAⅢ裂解。噬菌体DNAⅢ对于23株耐药MTB临床分离株，宽噬率高达78.26%。而且DNAⅢ还能裂解MDR-TB和XDR-TB株。因此DNAⅢ治疗耐药结核临床运用前景良好。

吸附宿主菌是噬菌体感染宿主的第一步，抗血清可抑制吸附过程。K值越高抗原性越强[7]，DNAⅢ的K值为770.01，比D29的K值(1069.50)低，说明与D29相比机体更不容易清除DNAⅢ。噬菌体DNAⅢ的抗血清交叉中和实验说明DNAⅢ与其余8株噬菌体之间无交叉吸附表位。

4 结论

DNAⅢ潜伏期较短，裂解谱广，抗原性低，能直接杀灭耐药MTB，存在杀灭休眠菌及胞内菌可能，具有抗耐药结核潜力。噬菌体DNAⅢ可作为治疗耐药结核的噬菌体鸡尾酒疗法的配方噬菌体。