,3 ,3 李军*

1.贵州医科大学贵州省药物制剂重点实验室/省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室，贵州 贵阳 550004；2.思南田氏民族传统骨伤医院，贵州 铜仁 5651003.贵州医科大学药学院，贵州 贵阳 550025；4.民族药与中药开发应用教育部工程研究中心，贵州 贵阳 550004；

乳没活络散源于贵州省土家族民族处方，由三七、没药、乳香和制川乌等十味中药制成的散剂，具有活血化瘀、舒经活络、消肿止痛，促进骨折愈合功能，用于气滞血瘀型骨折、肿胀、瘀斑、肢节活动障碍等疾病，民间药用历史已有两百余年，临床疗效确切。贵州省思南田氏民族传统骨伤医院根据该验方开发了医疗机构制剂(批准文号：黔药制字Z20170134)，该制剂已临床使用三十余年，疗效显著，深受患者欢迎。为有效控制乳没活络散的质量，本研究拟以乳没活络散中主药三七的人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1为特征性指标成分，建立乳没活络散的含量测定控制方法，并对乳没活络散的稳定性进行考察。

1 仪器与材料

1.1 仪器 ULmate3000高效液相色谱仪(美国Thermo公司)，LC-20AD高效液相色谱仪(日本岛津公司)；TGL-16G高速离心机(上海安亭科学仪器厂)；AE240十万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)。

1.2 材料 乳没活络散(批号：20160113、20160116、20160121、20170708、20170712、20170915，规格：20g/袋)；人参皂苷Rg1对照品(批号：110703-201529)、人参皂苷Rb1对照品(批号：110704-201424)和三七皂苷R1对照品(批号：110745-201318)均购自中国药品生物制品鉴定所；乙腈(色谱纯，天津科密欧化学制剂有限公司)，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液的制备 分别称取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1对照品10.67，18.91，21.68 mg，置10 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制得每1 mL含三七皂苷R11.067 g/L、人参皂苷Rg11.891 g/L和人参皂苷Rb12.168 g/L的混合对照品储备液。分别精密吸取混合对照品储备液0.2、0.4、0.8、1.6、2 mL分别置5个5 mL量瓶中，分别加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，制得三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1系列对照品工作液。

2.1.2 供试品溶液及缺三七药材阴性对照液的制备 取乳没活络散供试品1 g，精密称定，置索式提取器中，加乙醚50 mL，加热回流1 h，放冷，弃去乙醚液，药渣挥干，加甲醇50 mL，加热回流5 h，放冷，提取液蒸至近干，残渣加氨试液10 mL使溶解，移置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次20 mL，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水20 mL洗涤1次，分取正丁醇液，蒸至近干，残渣用适量50 %甲醇溶解，转移至10 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。另取按本品制备工艺制备的缺三七药材阴性制剂1 g，精密称定，同法制备阴性对照液。

2.2 色谱条件及专属性考察 色谱柱：Inertsil ODS-3(4.6×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-水(B)梯度洗脱，洗脱程序(0～12 min，19%A；12～32 min，19%～30%A；32～40 min，30%A；40～54 min，30%～38%A；54～60 min，38%A)；流速：1.0 mL/min；柱温45℃；检测波长203 nm。在该色谱条件下，各色谱峰与样品中其他组分色谱峰达基线分离，三七皂苷R1理论板数大于79000，如图1所示。

2.3 线性关系考察 分别精密吸取上述对照品系列工作液10 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积，以峰面积Y为纵坐标，进样浓度(mg/L)为横坐标进行线性回归，分别计算线性回归方程，结果见表1。

表1 线性范围考察

2.4 精密度试验

2.4.1 重复性试验 精密称定取本品0.5，1，1.5 g，照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，精密量取供试品溶液10 μL进样测定，并计算平均含量。每个称量做3个平行。在取样为0.5～1.5 g时，三七皂苷R1，平均含量为0.1054%，RSD为1.7%(n=9)；人参皂苷Rg1平均含量为0.5781%，RSD为1.9%(n=9)；人参皂苷Rb1平均含量为0.5234%，RSD为1.4%(n=9)。表明在称量0.5～1.5 g范围内该方法重复性良好。

2.4.2 中间精密度 以不同的实验人员在不同时间按供试品溶液制备方法分别制备3份供试品溶液并测定。三七皂苷R1平均含量为0.1061%，RSD为1.6%(n=6)；人参皂苷Rg1平均含量为0.5788%，RSD为1.8%(n=6)；人参皂苷Rb1的平均含量为0.5202%之间，RSD为2.0%(n=6)。测定结果显示表示方法的中间精密度良好。

2.5 加样回收率 取已测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和含量的制剂(三七皂苷R10.1054%，人参皂苷Rg10.5781%，人参皂苷Rb10.5234%)0.5 g，精密称定，每个称量平行3份，分别按所取样品量中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1质量数的50%、100%和150%的量精密加入对照品，照供试品溶液制备方法制备供试液，测定结果显示三种被测定化合物的回收率在99.78%～101.4%之间，RSD在1.3 %～2.5%(n=9)之间，说明加样回收率良好。

2.6 耐用性试验 为考察所建立的分析方法耐用性，对供试品溶液的稳定性、不同色谱柱温、不同检测波长、不同流速、不同品牌色谱柱、不同品牌的仪器分别进行考察。

2.6.1 供试品溶液稳定性考察 取同一供试品，按供试品溶液制备方法制备供试液，分别于0、2、4、8、24 h进样，结果人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1峰面积的RSD分别为0.62%～1.5%(n=5)，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.6.2 不同色谱柱分析结果比较 按拟定的色谱条件，用Inertsil ODS-3(4.6 mm×250 mm, 5 μm)、Phenomonex C18(4.6 mm×250 mm, 4 μm)和伊利特C18(5.0 mm×200mm, 5 μm)3种色谱柱对同一批号供试品进行测定。三七皂苷R1平均含量为0.1056%，RSD为2.2%(n=6)；人参皂苷Rg1平均含量为0.5784%(n=6)，RSD为1.5%(n=6)；人参皂苷Rb1的平均含量为0.5233%，RSD为1.9%(n=6)。

2.6.3 不同流速测定结果比较 以Inertsil ODS-3(4.6 mm×250 mm, 5 μm)色谱柱，以相同的流动相和洗脱梯度条件，分别按0.95、1.00和1.05 mL/min不同流速的进行分析。三七皂苷R1平均含量为0.1079%，RSD为2.7%(n=9)；人参皂苷Rg1平均含量为0.5790%，RSD为1.0%(n=9)；人参皂苷Rb1的平均含量为0.5201%之间，RSD为2.3%(n=9)。结果表明三种流速测试的结果基本一致。

2.6.4 不同柱温测定结果比较 以Inertsil ODS-3(4.6 mm×250 mm, 5 μm)色谱柱，按相同梯度和流速进行洗脱，分别33℃、35℃、和37℃进行分析。三七皂苷R1平均含量为0.1110%，RSD为2.2%(n=9)；人参皂苷Rg1平均含量为0.5790，RSD为1.7%(n=9)；人参皂苷Rb1的平均含量为0.5264%，RSD为1.0%～2.6%(n=9)。

2.6.5 不同检测波长测定结果比较 以Inertsil ODS-3(4.6 mm×250 mm, 5 μm)色谱柱，分别以201 nm、203 nm和205 nm进行检测，其余色谱条件不变进行测定。三七皂苷R1平均含量为0.1107%，RSD为1.7%(n=9)；人参皂苷Rg1平均含量为0.5974%，RSD为2.0%(n=9)；人参皂苷Rb1的平均含量为0.5285%之间，RSD为2.3%(n=9)。结果表明波长的小幅变动对测定结果基本不影响。

2.6.6 不同型号仪器分析结果比较 按拟定的色谱条件，采用Inertsil ODS-3(4.6 mm×250 mm, 5 μm)色谱柱，以Thermo ULmate3000和岛津 LC-20AD高效液相色谱仪对同一批号供试品进行测定，结果三七皂苷R1平均含量为0.1092%，RSD为1.7%(n=6)；人参皂苷Rg1平均含量为0.5790%，RSD为1.3%(n=6)；人参皂苷Rb1的平均含量为0.5248%，RSD为2.3%(n=6)。

2.6.7 制剂中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1含量测定 取三批次乳没活络散，按照本方法进行样品处理和成分测定，结果见表2。

表2 乳没活络散中三种成分测定结果 (%，n=2)

2. 7 乳没活络散稳定性研究

2.7.1 加速稳定性考察 取模拟医院制剂包装样品(20160113、20160116和20160121批次)，置温度(40±2)℃，相对湿度75%±5%，分别于0、1、2、3、6月取样进行检测。测定结果表明，本品所测三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1含量。试验结果表明，经过6个月加速试验考察，制剂中的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1含量没有明显变化，分别为0.1075%～0.1119%、0.5567%～0.5661%和0.5012%～0.5148%，符合质量标准要求。

2.7.2 长期稳定性考察 取模拟医院制剂包装样品，室温贮藏24个月。分别于0、3、6、9、12、18、24月取样进行检测。测定结果表明，本品所测三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1含量。试验结果表明，经室温留样长期试验24个月，制剂中的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1含量没有明显变化，分别为0.1055%～0.1108%、0.5517%～0.5613%和 0.4981%～0.5118%，符合质量标准要求。

3 讨论

乳没活络散由十味药材组成，直接采用甲醇提取正丁醇萃取方法制备得到的供试品溶液杂质多，干扰严重，被测成分分离度达不到要求，同时，对色谱柱污染严重，因此需要进一步净化样品。根据皂苷类化合物理化性质，先采用乙醚去除制剂中的脂溶性成分，再用甲醇提取制剂三七中皂苷类化合物，将甲醇提取液蒸至近干后，残渣用氨试液溶解，转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇萃取皂苷类成分，除去酚酸类酸性成分，所得的供试品溶液进样分析时被测成分分离良好，杂质不干扰测定。

目前测定三七中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1含量的方法多采用高效液相色谱法梯度洗脱[1-8]，选用紫外检测器[1-5]、蒸发光检测器[6-8]进行测定。也有用超高效液相色谱法[9]测定其含量，但该法对仪器要求比较高，设备较昂贵，不易普及。本研究参考文献报道[1-5]，在《中国药典》[10]方法的基础上针对本方进行了不同色谱柱、不同流速等条件的改良测定，建立了从供试品制备到样品检测的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1含量测定方法。结果证明该法具有样品处理简单、专属性强、灵敏度高，重复性好等特点，可以作为乳没活络散的质量控制方法。在乳没活络散稳定性试验中，除三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1含量测定外，还分对外观性状、鉴别、各项检查及微生物等指标进行了考察，结果均符合质量标准要求，说明本品在24 个月内质量稳定，直接接触药品的包装对药品质量无影响，故乳没活络散的有效期暂定为24 个月。