microRNA194过表达抑制荷瘤小鼠肝癌细胞生长的实验研究*

2018-09-20杨学民李朝路李兆阳

实用肝脏病杂志 2018年5期

杨学民，李朝路，李兆阳

本研究通过构建microRNA194过表达的肝癌细胞，在体外细胞学和动物体内观察了microRNA194对肝癌细胞增殖的影响，同时初步探讨了microRNA194发挥作用的下游靶基因情况。

1 材料与方法

1.1 肝癌细胞Hep3B培养 Hep3B细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，使用含10%FBS的DMEM高糖培养基（Gibco公司）培养于细胞培养箱（37℃，5%CO2）。待细胞生长至对数生长期（融合度为70%～80%）时，行细胞传代和转染等后续实验。

1.2 microRNA194模拟物的合成合成microRNA194模拟物（microRNA194 mimics）和阴性对照（control）序列，由上海吉玛制药技术有限公司完成（表1）。

表1 microRNA194模拟物和阴性对照序列

1.3 过表达microRNA194肝癌细胞Hep3B构建按照LipofectamineTM 2000转染液（Invitrogen公司）说明书进行细胞转染，具体步骤，1，细胞准备：转染前24 h，将合适数量的Hep3B细胞接种于96孔板，加入用含10%FBS的DMEM高糖培养基100 μl/孔培养，使细胞融合度达到50%～70%；2，转染液的配制：A液：每孔microRNA194模拟物和阴性对照各4 pmol，溶于不含血清的Opti-MEM培养基（Gibco公司）25 μl；B 液：每孔 0.2 μl的LipofectamineTM 2000转染液溶于不含血清的Opti-MEM培养基25 μl，静置5 min。将A液与B液混匀，每孔共50 μl，静置20 min，以利于充分形成转染复合物；3，吸弃96孔板上清培养液，PBS洗涤，每孔加入不含血清的Opti-MEM培养基50 μl，随后加入第2步中配制的转染液（50 μl/孔），将96孔板置于细胞培养箱中继续培养6 h。然后，将培养上清液吸弃，加入新鲜配置的含10%FBS的DMEM高糖培养基，继续培养48 h；4，采用荧光定量PCR法检测microRNA194 mRNA水平，验证是否成功构建过表达microRNA194的肝癌细胞Hep3B，检测microRNA194的引物序列见表2，由上海生工生物工程有限公司合成。