李俊峰，郑素军，刘霜，任锋，陈煜，段钟平

在糖鞘脂代谢过程中，葡萄糖化神经酰胺合成酶（glucosy lceramide synthase，GCS）是催化神经酰胺进行糖基化的关键酶[1-5]。我们之前的研究均表明鞘脂及其代谢在多种肝脏疾病的发生发展中扮演重要的角色[6-8]。最近我们发现丙型肝炎患者血浆糖化神经酰胺的变化与肝内坏死性炎症的发生风险明显相关[9]。我们推测内源性GCS可能与肝细胞的增殖和凋亡有一定的联系。本研究利用体外siRNA技术干扰GCS基因表达，观察了肝细胞的增殖和相关凋亡通路的变化，目的在于探讨GCS在肝细胞增殖过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞 人源肝细胞株7702细胞为首都医科大学附属北京佑安医院人工肝中心长期保存。RPMI 1640培养基（美国Hyclone公司），10%胎牛血清（美国Hyclone公司），细胞培养箱（美国Thermo公司）。

1.2 siRNA转染细胞 取对数生长期的7702细胞，每孔取1×105细胞，铺于24孔板。置于培养箱中培养24 h，待细胞贴壁后弃去上清，每孔加入siRNA和Lipofectamin 2000混合液。同时将无血清无抗生素的1640培养基作为空白对照组，同时将只加转染试剂的Lipofectamin 2000作为转染试剂组。培养6 h，在荧光显微镜下观察转染效率。采用实时荧光定量PCR法检测UDP-葡萄糖神经酰胺葡萄糖基转移酶（UDP-glucose ceramide glucosyltransferase，UGCG）siRNA对靶基因GCS的干扰效果。UGCG siRNA 序列为：正向（5’→3’）CGC GAA UCC AUG ACA AUA UTT，反向 （5’→3’）AUA UUG UCA UGG AUU CGC GTT；阴性对照siRNA序列为：正向 （5’→3’）GCGACGAUCUGCCUAAGA UdTdT，反向（5’→3’）AUC UUA GGC AGA UCG UCG UCG CdTdT。人 GCS 引物序列：正向（5’→3’）TTC ATG TGT CAT TGC CTG GC，反向（5’→3’）AGC GTA ATC TGT AGC GAC CA。

1.3 UGCG siRNA对肝细胞增殖的影响 采用MTT法检测。

1.4 细胞 Bcl-2、Bax和 Caspase 3基因水平检测 采用实时荧光定量PCR法，取7702细胞1×105个/孔，铺种于24孔板，加入完全培养基1 mL，培养细胞24 h，待细胞贴壁生长后，分为转染组和UGCG siRNA干预组，培养6 h，换成无血清培养基，继续培养至24 h。……