史晓贤 李高文

[摘要] 目的 探讨基因表达谱在筛选糖尿病肾病有效治疗药物中的应用效果。 方法 在GEO数据库中搜索与糖尿病肾病相关的基因芯片，利用d-chip软件进行差异基因的表达分析，采用基因集富集的方法（GSEA）进行相关信号通路的富集分析，再利用Cmap筛选治疗糖尿病肾病的候选药物，并通过动物实验进行药效学评估。 结果 通过对GSE31022芯片中的合格样本进行差异基因的有效分析，在获得的540个差异表达基因中，上调基因150个，下调基因390个；通过GSEA分析主要富集到NF-κB信号通路与糖尿病肾病最为密切（P < 0.05），并且筛选出甲砜霉素可能对糖尿病肾病有治疗作用（score=1），动物实验结果显示，与模型组比较，甲砜霉素组的肾小球硬化及系膜扩张明显改善，基本达到正常组水平，差异有统计学意义（P < 0.05）。此外，甲砜霉素组的尿蛋白和CD68、转化生长因子β、纤溶酶原激活物抑制物1及白介素6的mRNA水平低于模型组（P < 0.05）。 结论 基于糖尿病肾病相关基因表达谱作为疾病有效治疗药物的预测手段，为疾病的治疗药物发现提供了新思路。

[关键词] 基因芯片；糖尿病肾病；甲砜霉素；基因表达谱；富集分析

[中图分类号] R587.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）08（a）-0018-05

[Abstract] Objective To explore the application effects of gene expression profiling in screening the effective therapeutic drugs for diabetic nephropathy. Methods The gene chips related to diabetic nephropathy in GEO databases were searched and the differential gene expression was analyzed by d-chip software. Enrichment analysis of the relevant signaling pathways was carried out by GSEA， Cmap was then used for the screening of candidate drugs of diabetic nephropathy and pharmacodynamic validation was evaluated in animal experiments. Results Through the analysis of differential genes in qualified samples from the GSE31022 chip， a total of 540 genes were obtained， of which， 150 genes were up-regulated and 390 genes were down-regulated. The main enrichment to NF-κB signaling pathway by GSEA was most closely related to diabetic nephropathy （P < 0.05）， and screening for Thiamphenicol may have a therapeutic effect on diabetic nephropathy （score=1）. The results of animal experiments showed that compared with model group， the mesangial expansion of the diabetic nephropathy mice treated by Thiamphenicol was significantly improved and almost reached the normal level （P < 0.05）. In addition， the levels of urine protein and the mRNA levels of CD68， transforming growth factor β， plasminogen activator inhibitor 1 and interleukin 6 in the Thiamphenicol group were significantly lower than those in model group （P < 0.05）. Conclusion As an effective means of predicting effective therapeutic drugs for diabetic nephropathy， the gene expression profiling based on diabetic nephropathy provides a new idea for the discovery of therapeutic drugs for the disease.

[Key words] Gene chips； Diabetic nephroathy； Thiamphenicol； Gene expression profiling； Enrichment analysis

糖尿病是一種以高血糖为主要特征的慢性代谢性疾病，引发的各类并发症更加深了糖尿病患者的致死率和致残率[1-4]。其中糖尿病肾病已经成为最常见的糖尿病并发症之一[5-6]。作为严重危害人类健康的疾病，目前对糖尿病肾病治疗仍集中在抗炎、降血糖及血脂和改善血流动力学等方面，缺乏安全有效的治疗药物[7]。近年来，利用基因表达谱技术和关联性图谱（Cmap）数据库筛选和发现药物成为一个新的研究热点[4，8]。因此，为了快速有效地发现新的治疗糖尿病肾病的有效候选药物，本研究从GEO数据库中搜索与糖尿病肾病相关的基因表达谱数据集，筛选出样本数较多的基因芯片：GSE30122；然后利用R软件进行差异基因的分析，获得了与糖尿病肾病相关的差异基因，对差异基因进行分析后，显示甲砜霉素（Thiamphenicol）的负性富集分数最高，表明甲砜霉素具有潜在的改善糖尿病肾病的生物学功能。

1 材料与方法

1.1 GEO数据集的获取

从GEO数据库中搜索与糖尿病肾病相关的基因芯片，从中筛选并下载了基因表达谱数据集，采用GPL571芯片平台。

1.2 糖尿病肾病的相关差异表达基因分析

采用R软件对GSE31022芯片中的合格样本进行差异基因的有效分析，具体操作参考d-chip说明[9]，进行显著性分析的P值< 0.05和差异基因倍数≥1.2倍。

1.3 相关基因集的富集分析

从NCBI的GEO数据库中获得与糖尿病肾病相关的数据集进行GSEA基因集富集分析。然后从GSEA网站的数据库中选取Canonical pathways、KEGG gene sets、GO gene sets、GO biological process四个基因集作为阳性参照基因集。按照default weighted enrichment statistic的方法重复分析1000次，P < 0.05的通路/过程定义为显著富集分析通路[10]。

1.4 筛选糖尿病肾病的治疗药物

通过Cmap数据库进行糖尿病肾病的有效治疗药物的筛选，首先通过R软件进行基因集的富集分析，获得上调或者下调的相关基因，然后将基因名转换成为“Affymetrix gene chip Human GenomeU133A Array”的标准探针，转换成query signature格式的文件，最后在Cmap网站分别上传差异基因文件。

1.5 利用动物模型评估甲砜霉素对糖尿病肾病的作用

1.5.1 动物 本研究选用8周龄的2型糖尿病小鼠为肾病模型（db/db），选取同窝野生型的5周龄的正常小鼠（db/m）8只为正常组，另设甲砜霉素组和模型组，共计三组，以上小鼠均购自南京模式动物所，实验动物合格证编号：SYHG（苏）2017-0005。实验动物饲养在SPF级的动物房，动物自由摄食和饮水。腹腔给药（10 mg/kg），每天给药1次，连续给药13周，最后1周收集24 h尿液，并检测尿白蛋白含量。

1.5.2 实验器材 血糖仪（罗氏卓越型）；尿蛋白定量试剂盒（长风生物科技有限公司）；紫外可见分光光度计（贝克曼）；摇床（苏州高科）；图像采集系统（高科生物公司）；酶标仪（GE公司）；电泳槽、电泳仪、凝胶图像分析管理系统、荧光定量PCR仪均购于杭州宝诚生物技术有限公司。

1.5.3 药物和试剂 动物饲料：高脂饲料（南京吉凯饲料有限公司）；甲砜霉素（上海天平制药有限公司）；PCR引物（上海生工生物公司）；尿蛋白测量试剂盒、mRNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR试剂盒、糖原染色试剂盒均购于全式金生物公司。

1.6 组织病理学检查

PAS染色：将取下的新鲜肾组织放入4%的多聚甲醛中过夜，石蜡包埋，切成5 μm，脱蜡，漂洗后，按照糖原染色的方法染色，在正置显微镜下观察肾组织的病理状况，记录数据。

1.7 相关炎症因子的基因水平检测

将新鲜肾脏组织0.5 g置于1.5 mL灭菌过的EP管中，分别加入1 mL的Trizol，提取mRNA，按照逆转录试剂盒说明逆转录为cDNA，通过qPCR进行定量分析CD68、白介素6（IL-6）、转化生长因子β（TGF-β）、纤溶酶原激活物抑制物1（PAI-1）在各个组的肾组织中的基因水平。

1.8 統计学方法

采用SPSS 20.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示：符合正态分布的数据，使用单因素方差分析；不符合正态分布的数据，采用非参数检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GEO数据集信息

9个糖尿病肾病和13个正常样本共22个样本全部合格。

2.2 糖尿病肾病相关差异基因筛选

用糖尿病样本对比正常样本，获得共同差异表达基因540个，其中上调基因150个，下调基因390个，差异基因热图也提示糖尿病肾病组织样本和正常组肾病组织的样本聚类分界明确（图1，封三）。

2.3 糖尿病肾病的通路富集分析

NF-κB等35条信号通路与糖尿病肾病的发生和发展相关，其中NF-κB信号通路差异有统计学意义（P < 0.05）。见图2（封三）。

2.4 Cmap数据库分析

结合富集分数和P值两项参数对所获的药物进行差异排序（图3），最终筛选出甲砜霉素的负性富集分数最高，提示可能会成为糖尿病肾病的有效治疗药物或者辅助治疗药物。

2.5 甲砜霉素可以有效缓解糖尿病肾病

2.5.1 糖尿病肾病小鼠实验 糖尿病小鼠的给药剂量和给药时间见图4A，结果显示甲砜霉素组小鼠的尿白蛋白排出量明显低于模型组（P < 0.05），基本达到了正常小鼠的水平（图4B）。此外肾脏组织糖原染色分析发现，相比于模型组，甲砜霉素组的肾小球硬化和肾系膜扩张得到了有效的改善，基本恢复正常（图4C、D）。

2.5.2 肾脏组织中的炎症因子表达水平 糖尿病肾病小鼠在给予甲砜霉素治疗后，肾组织中CD68、TGF-β、PAI-1、IL-6等炎症因子的mRNA水平相比模型组都显著降低（P < 0.05或P < 0.01），基本接近正常值（图5）。

3 讨论

糖尿病肾病是一种肾脏长期处于高糖环境下所导致的疾病，其发病机制涉及各种复杂的病理环境[11-14]。近年来，虽然有许多学者对糖尿病肾病的发病机制做了大量的报道[15-16]，但其机制依然没有阐明。基因表达数据库是一个基于基因表达谱的药物发现平台，其有效地揭示了药物、疾病和基因三者之间的联系，并且在“老药新用”及新药发现方面具有非常重要的应用价值[17]。此外，基于疾病与基因表达谱的关联来发现药物的模式能够极大缩短药物研发时间周期，具有非常重要的社会和经济意义[18-19]。本研究采用基因表达数据库的药物筛选平台，最终获得甲砜霉素等可能是糖尿病肾病的有效候选药物。在筛选到的候选药物中，甘氨酸-组氨酸-赖氨酸等氨基酸的代谢对肝、肾功能具有一定的保护作用[20]。此外，利用筛选到的候选药物——甲砜霉素通过体内动物实验进一步去评估其对糖尿病肾病的作用。本研究检测尿蛋白含量，结果显示甲砜霉素组小鼠的尿白蛋白排出量明显低于模型组，基本达到了正常小鼠的水平，提示甲砜霉素可以有效缓解和改善糖尿病肾病所引起的尿白蛋白增多，有助于糖尿病小鼠肾功能的改善。此外肾脏的病理切片染色发现，相比于模型组，甲砜霉素组的肾小球硬化及肾系膜扩张程度明显得到了有效的改善，基本也恢复正常，并且CD68、TGF-β、PAI-1、IL-6炎症因子的mRNA的水平也显著降低，提示甲砜霉素也能够缓解糖尿病肾病的炎症，但其确切的作用机制尚需进一步研究。

因此，本研究所建立的基于疾病与其相关基因表达谱的方法可以筛选出治疗糖尿病肾病的药物，相关的文献分析也验证了该方法的可行性[17-19]。本研究仅从体内动物水平初步提示其具有缓解糖尿病肾病的作用，但具体的机制以及其临床疗效等有待进一步的探讨。

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