方政，董玉瑛，赵晶晶，邹学军

大连民族大学环境与资源学院，大连 116605

近些年，随着不同水源中陆续检测出医药品活性成分相关的微量有机污染物，其引发的对人类生存及生态环境风险问题已受到国内外环境学者及社会大众的广泛关注[1-2]。布洛芬作为苯丙酸类新一代非甾体类消炎镇痛药物的典型代表，由于毒性低、疗效好及副作用小而得到世界卫生组织、美国食品药品监督管理局(FDA)唯一共同推荐的儿童退烧药得到广泛应用[3-5]；阿奇霉素属半合成的十五元环内酯类抗生素，因其引起不良反应的发生率小，受性良好，所以在治疗人类和动物感染方面具有较一般抗生素类更好的疗效[6-8]；而三氯生(TCS)是一种常用的高效抗菌剂，医药品中常见为三氯生乳膏，因其对多种细菌、真菌具有杀灭和抑制作用，能够作为医药品与个人护理品的杀菌、防腐剂，进而在环境中存在较为普遍[9]。这些常见医药中存在的活性成分释放到环境中能够对人体健康及生态环境造成不同程度的威胁，同时这类污染物往往在全球范围内普遍存在，在环境中具有较高的稳定性，难以降解且易在生态系统中富集[10-11]，对环境中包括人类在内的各类生物产生的危害不容忽视。

当环境通过自净能力却不能完全去除残留在环境中的新型污染物，如抗生素等药品活性成分时，还可能出现环境中的耐药菌株大量增加的生态现象，增大了耐药菌对人与其他生物感染的风险。现实生活中，以抗生素为代表的常见医药品往往都以混合物的形式存在[12]，本研究中选择的3种常见医药品在生活中作为解热镇痛类药品、抗感染类药品及杀菌类药品使用，在生活中，如人类及动物遇到发热及敏感细菌急性皮炎等情况时会相互搭配使用。方淑霞等[13]的研究表明，环境中抗生素等医药品混合物间总表现出与单一化合物不同的毒性作用。现阶段已有关于这3种医药品混合物对环境影响方面的研究，武小燕[14]在关于布洛芬、三氯生对黄颡鱼酶及抗氧化酶系的毒性效应研究中得到结论，混合暴露的结果与布洛芬和三氯生单独对黄颡鱼进行暴露的结果不同。李义刚[15]在三氯生、布洛芬和氯化镉对羊角月牙藻的毒性效应研究中，对布洛芬和三氯生对羊角月牙藻的毒性进行了分析，结果表明，三氯生对羊角月牙藻属于高毒物质，布洛芬对羊角月牙藻体内抗氧化酶系中CAT和MDA也有较大影响，氯化镉和三氯生对羊角月牙藻联合毒性表现为拮抗作用，氯化镉和布洛芬对羊角月牙藻联合毒性表现为协同作用。李义刚[15]的研究中并未对三氯生和布洛芬的联合作用进行分析。关于布洛芬、阿奇霉素和三氯生这3种药品在环境中的联合毒性作用研究目前还比较少见，因此，全面和及时了解这3种常见医药品混合物在环境中生态毒性效应已迫在眉睫。本实验结合发光菌具有快速、灵敏、操作简单、应用范围广泛等优点，将其作为受试生物，研究布洛芬、阿奇霉素和三氯生3种医药品在环境中的单一及联合作用，为评价该类新型污染物对环境及生物的影响提供基础数据。

1 材料与方法 (Materials and methods)

1.1 实验仪器

恒温振荡器；恒温培养箱；恒温磁力搅拌器；高压蒸气灭菌锅；洁净工作台；BS214D型电子天平；DXY22型生物毒性测试仪；量程不同的精密移液器等。

1.2 试剂材料

1.2.1 主要试剂

布洛芬缓释胶囊和阿奇霉素分散片购于长春海外制药集团有限公司和东北制药集团沈阳第一制药有限公司，采用校正后的有效成分含量进行配制。三氯生和氯化钠等试剂均为分析纯。

1.2.2 菌种的培养

发光菌冻干粉制剂的复苏：无菌条件下，取已灭菌的3% NaCl溶液1 mL加入于明亮发光杆菌(Photobacterium phosphoreum)的冻干粉制剂中，均匀混合，常温下放置2 min后，明亮发光菌即为复苏。

斜面菌种的培养：明亮发光菌复苏完成后，立刻将已复苏的明亮发光菌用已灭菌的接种棒转接至斜面培养基中，20 ℃下恒温培养24 h后转接第二代，并将第二代置于20 ℃下恒温培养24 h后，继续转接第三代，并于20 ℃下培养24 h后放置于冰箱中备用保存，以上操作均需在无菌条件下进行。

摇瓶菌液的培养：将上述制得的明亮发光菌第三代斜面菌菌种转接到含有100 mL培养液的250 mL锥形瓶中，于20 ℃振荡培养至对数生长期备用。

工作菌液的制备：吸取一定量的摇瓶菌液于3% NaCl溶液中，充分搅拌，发光强度控制在300～900为宜。

1.3 急性毒性EC50的测定

发光细菌急性毒性测试经预试验、单一毒性分析和联合毒性分析等步骤实施。

1.3.1 预实验

对选定的试剂设置浓度梯度进行试验，观察15 min时待测化合物对明亮发光菌的发光抑制率，并确定适宜的毒性实验暴露浓度范围。

1.3.2 单一毒性EC50的测定

基于预实验的基础，进行单一实验，将待测化合物用3% NaCl溶液稀释配制为13个对数等间距分布的浓度，吸取不同梯度的样品溶液2 mL于具塞磨口比色管中，以2 mL 3%NaCl 溶液作空白对照，再将0.5 mL 的工作菌液加入测试管中，加塞上下振荡均匀，去塞，精确计时暴露15 min时测定发光强度。每组浓度梯度做3个平行样，确保毒性分析结果标准偏差低于10%。

1.3.3 联合毒性EC50的测定

根据单一毒性测试的实验结果，绘制毒性作用的效应-剂量曲线，以获得3种医药品对发光菌的单一毒性EC50；并将待测物布洛芬、阿奇霉素、三氯生根据单一毒性测得的EC40、EC45、EC50、EC55、EC60，按等毒性比例配制二元及多元混合体系，以3%NaCl为空白对照，每组浓度设置3个平行，确保3组平行实验的标准偏差低于10%，测定二元及三元混合体系医药品对发光菌的联合毒性作用的EC50。

1.4 数据处理

由于3种医药品浓度与对应的发光抑制率在EC50附近呈良好的线性分布关系，进而采用Excel绘图，测得样品溶液的发光强度与空白对照的发光强度之比即为抑制率，其表达式为：

以抑制率对浓度作图，求得抑制率为50%时的化合物溶液浓度，即为EC50。化合物浓度和死亡率之间的相关系数r，经显著水平检验，置信区间范围大于90%。

1.5 联合毒性评价方法

多元混合体系下的污染物对生物体的联合毒性作用类型包括独立作用、协同作用、相加作用和拮抗作用4种，本实验应用相加指数法(AI)、毒性单位法(TU)、混合毒性指数法(MTI)3种评价方法对3种医药品二元及三元混合体系的作用类型进行定量判别和分析[16]，联合毒性作用类型评价标准见表1。

2 结果与讨论(Results and discussion)

2.1 单一毒性作用测试分析

3种医药品对发光菌均呈现出不同程度的抑制作用，其对发光菌的半数效应浓度(EC50)分别为：36.5×10-5、30.26×10-5和0.0155×10-5mol·L-1；其毒性强弱作用为：三氯生>阿奇霉素>布洛芬，即三氯生的毒性作用最强。图1为3种医药品的分子结构式，顺序依次为布洛芬、阿奇霉素、三氯生。从结构图中可以看出，3种医药品的取代基为-OH、-Cl。翟丽华[17]选取17个部分取代苯化合物，研究其对发光菌的急性毒性，得取代基对发光菌的毒性贡献大小顺序为：-NO2>-Cl>-CH3>-NH2>-OH。翟丽华[17]的实验结论对本研究结果具有借鉴意义。因此推断3种不同医药品对发光菌的抑制效应的差异，是由于不同取代基影响作用效应程度不同导致的。对于这种结论仍需进一步对分子相互作用机制进行深入研究。

图1 3种医药品结构式Fig. 1 The structure of three kinds of pharmaceuticals

表1 不同评价指数的联合作用类型判断标准Table 1 The joint toxicity types and standards of different evaluating methods

2.2 二元混合体系的联合毒性评价

综合分析二元混合体系对发光菌的联合毒性作用(见表3)，我们可以看出，等毒性比例混合时，3种医药品二元联合毒性的EC50值明显大于单一毒性的EC50，表明二元混合体系的毒性低于单一毒性作用。同时，由于阿奇霉素+布洛芬，三氯生+布洛芬，三氯生+阿奇霉素这3组二元混合体系的M均大于M0，AI和MTI均小于0，因此这3组混合体系的作用类型表现为拮抗作用。由于AI越接近于0，其作用类型越趋于相加作用，而MTI越接近于0，其作用类型越趋于独立作用，因此根据3组二元混合体系的AI及MTI的不同，可判断其拮抗作用强弱的差异，进而判定3种医药品二元混合体系对发光菌的作用强度为：三氯生+阿奇霉素>三氯生+布洛芬>阿奇霉素+布洛芬。

2.3 三元混合体系的联合毒性评价

由于二元混合体系联合毒性表现为拮抗作用，因此猜测3种医药品分子间的相互作用可导致体系联合毒性降低，多个二元拮抗体系累加，各分子间相互作用增强可导致多元混合体系继续呈现拮抗作用。实验结果得出三元混合体系联合毒性评价参数和作用类型见表4，等毒性比例混合的三元混合体系的联合毒性EC50明显大于二元和单一毒性作用的EC50值，表明三元混合体系的毒性更弱。由于等毒性比三元混合体系的M均大于M0，AI小于0，MTI小于0，因此三元混合体系的联合作用类型为拮抗作用。本实验获得联合毒性类型为拮抗作用，与前人研究结果相一致。丛永平等[18]研究发现四环素类抗生素和氯霉素类抗生素对发光菌的联合急性毒性也表现出拮抗作用。

表2 3种医药品单独作用时的EC50Table 2 EC50 values when three kinds of drugs act alone

表3 二元混合体系的EC50值和联合毒性评价参数及作用类型Table 3 EC50 values, and joint toxicity evaluation parameters and action types of binary mixtures

表4 三元混合体系的EC50值和联合毒性评价参数和作用类型Table 4 EC50 values, and joint toxicity evaluation parameters and action types of ternary mixtures

2.4 毒性作用机制初步探讨及其类型评价

综合分析二元、三元混合体系联合毒性，均为拮抗效应，因此猜测3种医药品的活性成分能够相互作用并导致联合毒性降低，各活性成分间相互作用增强导致多元混合体系呈现拮抗。而我们的实验结果也与假设相符，任皓等[19]对盐酸吉他霉素与金霉素、盐霉素、黄霉素对发光细菌联合毒性作用实验的研究结果表明：在多个混合体中，拮抗作用表现较强的分子混合体系起主导作用。方章顺等[20]研究典型抗生素与群体感应抑制剂对费氏弧菌的三元慢性联合毒性，证明了两元混合体系的拮抗作用是三元体系拮抗作用的根本原因。由此可见，污染物在环境中经过各途径混合后，其相互作用可能导致毒性减弱。对于呈现的这种联合作用效应，也可用发光菌发光原理进行初步的联合毒性分析，发光细菌的发光机制基本都存在细菌荧光素酶(LE)、还原态黄素单核苷酸(FMNH2)、氧气(O2)、长链脂肪醛(RCHO)的参与[19, 21-22]。其发光反应方程式如下：

在这一反应过程中，黄素单核苷酸作为重要的辅酶，其氧化形式(FMN)与还原形式(FMNH2)之间的转化在整个反应过程中起到了传递氢的作用。实验中3种常见医药品分子中均含有羟基(-OH)易与黄素单核苷酸结合形成氢键，阻碍发光反应中FMNH2在氧化和还原作用之间氢的传递，干扰正常的发光反应进程，抑制发光菌发光。与此同时，由于阿奇霉素和布洛芬的分子中均含有N元素，N元素作为一种营养因子，在一定程度上能够对发光反应过程起到促进作用[21, 23-24]，降低了其他化合物对发光强度的抑制效果，进而呈现出了拮抗这种作用类型。如想更具体地对引起拮抗作用的原因进行分析，还需进一步对测试污染物联合作用的机制以及发光菌的生理生化反应等进行深入探索。就目前的实验结果而言，我们可以推断出这3种医药品能够对水体环境及水生生物，例如微生物、浮游生物、藻类、鱼类等有同样的毒性作用，而药物毒性在水生生物体内富集，一旦进入水源并通过食物链逐级递增进入人体，毒性在人体内部将被放大，所以无论是现在或是未来，医药品这类新兴污染物都将会对环境及生物造成很大的威胁，对于此类污染物的联合作用研究迫在眉睫。