王作铭，陈军，陈静，徐汉杰

上海师范大学生命与环境科学学院，上海 200234

抗生素被广泛用于人类和动物感染性疾病的治疗，同时也被作为促生长剂添加于饲料中在养殖业中大量应用[1]；我国是抗生素生产和使用大国，且滥用现象严重[2]；抗生素在使用之后，大量未被代谢的抗生素经不同途径最终进入水体[3]，在我国各地江河流域中普遍发现了抗生素残留的现象[4]，因此抗生素对水生态的影响特别严重，也是当前国内外最受关注的环境污染问题之一[5]。虽然，水体中抗生素的残留浓度不高且半衰期不长，检出水平常在μg·L-1和ng·L-1级别，但由于抗生素被频繁地使用并进入了水环境，使得抗生素在水体中持续存在，即表现出“假持续”现象[6-8]；值得注意的是，这种现象极有可能会对水体中的微生物群落产生影响，并通过生物富集和食物链传递影响高级生物，破坏生态系统平衡，对整个水生态系统构成长期潜在风险[9-10]。

实际上，由于水体中残留的抗生素种类繁多和特定地域的限制，通过实验来评价环境中所有不同浓度的混合药物是不可能的[7,11]，为了预测联合毒性效应和识别药物之间的作用关系，毒性预测模型得到了发展[7]。目前，多采用浓度相加(CA)和独立作用(IA)传统模型进行毒性预测，缺陷是这2种传统模型忽视了药物之间的协同、拮抗作用。然而，水体中化合物之间不仅仅是简单的相加作用，也会发生相互作用而产生协同或拮抗效应[12]，抗生素对环境的危害作用可能会因共存而加强[13]。因此，考虑到当抗生素共存时判断相互作用发生与否对于准确评价水生态风险的重要性[9]，Chou[14]提出的联合指数(CI)模型被用于研究污染物相互作用[15-16]。

上海地处长江流域下游，是中国人口密度最高且经济最发达的城市之一；近年来，不同种类、浓度的抗生素在上海地区的地表水、地下水[4,17-18]，甚至在饮用水以及学生体内被检出[19-20]。因此，上海地区水体中抗生素污染风险不得不受到重视，而最直接的危害是通过影响水生生物破坏水生态健康。现有权威统计数据表明磺胺类、四环素类和氯霉素类抗生素是当前上海地区水体中被检出最多且污染最为严重的抗生素种类[4,17-18,21]，本文以这3类抗生素的3种代表物质即磺胺甲恶唑、土霉素和氟苯尼考为受试物质，以不同营养级的国际通用模式生物蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、费氏弧菌(Vibrio fischeri)、大型蚤(Daphnia magna)和斑马鱼胚胎(zebrafish embryo)为受试对象，进行了急性毒性研究，然后在其基础上开展联合毒性试验并用CA、IA和CI模型对抗生素的联合毒性进行了预测，同时用联合指数CI对不同浓度下药物之间作用关系(相加、协同、拮抗)进行了识别和评价；最后以近年来上海地区水体中抗生素主要来源(养殖废水、工厂废水)和主要地表水(黄浦江、长江口)的检出数据为指标，在CI模型基础上测试分析上海地区水体抗生素污染状况，评价其中的生态风险，为上海地区抗生素污染监测提供参考。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 供试材料

药品：磺胺甲恶唑(sulfamethoxazole, SMZ)购自阿拉丁，分析标准品，纯度为99%，试剂CAS编号为723-46-6；土霉素(oxytetracycline, OTC)购自阿拉丁，分析标准品，纯度为97%，试剂CAS编号为6153-64-6；氟苯尼考(florfenicol, FF)购自阿拉丁，分析标准品，纯度为98%，试剂CAS编号为73231-34-2。取待测化合物用适量二甲基亚砜(DMSO)配制成标准溶液备用(最终质量分数<0.1%)。

受试生物：蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、大型蚤(Daphnia magna)均为上海师范大学水生生物实验室保存种；费氏弧菌(Vibrio fischeri)由中国海洋大学海洋生命学院王祥红教授惠赠；斑马鱼(zebrafish)购于上海市奉贤区花鸟市场，试验前驯养一周以上，驯养期间，健康状态良好且无死亡。

试验用水及培养基：①曝气自来水：曝气除氯48 h以上的自来水。②大型蚤稀释用水：CaSO460 mg·L-1，MgSO460 mg·L-1，Na2CO396 mg·L-1，KCl 4 mg·L-1，pH 7.6。③斑马鱼胚胎培养水：CaCl2·2H2O 0.294 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.123 g·L-1，NaHCO30.065 g·L-1，KCl 0.006 g·L-1，用曝气48 h以上自来水溶解。④BG-11复合培养基：购于樊克生物有限公司⑤费氏弧菌液体培养基：NaCl 30 g·L-1，酵母膏5 g·L-1，胰蛋白胨5 g·L-1，甘油3 g·L-1，KH2PO41 g·L-1，Na2HPO45 g·L-1，pH 7.0，121 ℃蒸汽灭菌20 min。⑥费氏弧菌固体培养基：NaCl 30 g·L-1，酵母膏5 g·L-1，胰蛋白胨5 g·L-1，甘油3 g·L-1，KH2PO41 g·L-1，Na2HPO45 g·L-1，20 g·L-1琼脂，pH 7.0，121 ℃蒸汽灭菌20 min。

1.2 仪器

主要仪器包括AE20/21倒置生物显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司)；Tecan M200 PRO多功能酶标仪(瑞士帝肯公司)；PQX—350H人工气候箱(上海申贤恒温设备厂)。

1.3 受试生物的培养

(1)小球藻的培养：在无菌条件下，将对数期的藻种接种到100 mL BG-11培养基中，容器为250 mL锥形瓶，在温度(22±1) ℃、光照强度2 500 Lux，光暗比12 h∶12 h的条件下静置培养。每天的固定时间震荡3次以上(15 min/次)，每隔96 h移种一次。

(2)大型蚤的培养：大型蚤的扩大培养采用曝气自来水，培养温度为(20±1) ℃；光照强度为2 500 Lux；光暗比为12 h∶12 h。每隔2天换一次水并喂食蛋白核小球藻，投饵密度为2.0×105～3.0×105cells·L-1。实验前24 h选取怀卵的健康母蚤在稀释用水中进行培养，实验前6 h将母蚤挑出，挑选出生时间在6～24 h之间的幼蚤用于实验。期间喂食蛋白核小球藻，投饵密度为2.0×105～3.0×105cells·L-1，其他培养条件亦相同。

(3)斑马鱼的培养及胚胎的获取：将斑马鱼驯养于曝气自来水中，pH 7.5，温度(28.5±1) ℃，光暗比为14 h∶10 h，饵料为丰年虾，每日喂食2次并清理污物。选用鱼龄3个月以上的成鱼用于产卵，在繁殖前一天，将雌鱼和雄鱼以1∶2的比例放入孵化箱中的网兜中，网孔稍大于受精卵大小。设定好开灯时间，第2天开灯30 min内斑马鱼产卵完成。用胚胎培养水冲洗胚胎，在体视镜下挑取受精正常的胚胎用于暴露实验。

(4)费氏弧菌的培养及检测用菌液制备：无菌条件下，取适量斜面三代菌种接入5 mL液体培养基，在28 ℃、转速250 r·min-1条件下培养12 ～16 h。取活化的菌液100 μL涂布，将平板置于22 ℃培养箱中培养约22 h后，用3% NaCl 溶液将菌落洗下并稀释至约为107cfu·mL-1后作为工作菌液备用。

1.4 试验方法1.4.1 毒性指标的测定

(1)小球藻生长抑制试验

藻类生长抑制试验方法参照经济合作与发展组织(Organization for Economic Co-operation and Development, OECD)201标准方法[22]，取对数期的纯种藻液接种到100 mL BG-11培养基中，接种后的初始密度约2×105cells·mL-1。所测试抗生素设置8个浓度组，并设置空白对照，每组实验设置3个平行。经测定OD680nm与藻液密度(105cells·mL-1)线性相关方程为：Y=81.807 OD680nm，R2=0.9924。分别在24、48、72、96 h，取1 mL藻液测定吸光度，从而确定其浓度。按照公式(1)、(2)计算抑制率：

(1)

式中：A为生长曲线以下的面积；N0为T0时刻每毫升藻液中的藻细胞数；N1为T1时刻每毫升藻液中所测得的藻细胞数；Nn为Tn时刻每毫升藻液中所测得的藻细胞数；T1为试验开始后第一次计数的时间；Tn为试验开始后第n次计数的时间。

(2)

式中：IA为每一浓度下藻类细胞生长抑制百分率(%)；Ac为对照组生长曲线所包围的面积；At为处理组生长曲线所包围的面积。

(2)费氏弧菌发光抑制试验

费氏弧菌发光抑制试验方法参照国际标准化组织(International Organization for Standardization, ISO)11348-1(2009)标准方法[23]，并依据文献[24]进行适当修改；所测试抗生素用3% NaCl溶液稀释为9个浓度组，每组实验设置3个平行。取100 μL工作菌液加入到白色96孔板中，用多功能酶标仪测发光量，记为I0，然后加入等体积的待测抗生素溶液，振荡250 s充分混合均匀，然后在15 ℃的条件下检测30 min时的发光强度I。

(3)大型蚤急性毒性试验

大型蚤急性毒性试验方法参照OECD 202标准方法[25]，所测试抗生素用大型蚤稀释用水稀释为7个浓度组，每组实验设置3个平行。实验容器为50 mL烧杯，每个容器内装50 mL一定浓度的供试溶液，每一处理放18头同一母体6～24 h内的新生活泼个体进行试验，试验水温为(20±1) ℃、光暗比为14 h∶10 h，实验期间不进行喂食。24 h试验后观察大型蚤个体，大型蚤受抑制的判定是振荡试验溶液，在15 s内无反应，记录受抑制个数。

(4)斑马鱼胚胎急性毒性试验

斑马鱼胚胎急性毒性试验方法参照ISO15088(2007)标准方法[26]，选取4细胞至128细胞阶段下镜检正常的受精卵用于染毒实验，在24孔板中每孔加入6枚受精卵和2 mL受试液，每组放4个孔，设置6个浓度组和1个对照组。染毒48 h后出现凝结、不显示尾脱离以及未检出心跳状况均视为死亡。

上述指标的测定，除大型蚤急性毒性试验外，其他操作均为无菌操作。

1.4.2 联合毒性试验方法

在单一毒性的基础上，按照毒性单位1∶1的配比组成二元混合体系，测定混合体系对4种水生生物的联合毒性，试验方法和步骤与单一毒性的测定相同；二元混合物的总浓度为2个组分浓度之和。采用基于中效原理的中效方程来计算抗生素单独和联用的效果[27]，公式如下：

(3)

式中，D是剂量，Dm是产生中度效果的剂量，这是相当于有效剂量的中值剂量(EC50)，fa是反应系统中的D剂量的有效部分，fu=1-fa，m是剂量-效应曲线的系数。

根据定义，方程(3)可以变形为公式(4)

(4)

对于不同效应下的联合指数CI根据下列公式进行计算[14]：

(5)

采用CA、IA和CI模型对联合毒性作用进行预测。CA模型是基于混合体系中的所有物质都是通过相似的作用方式而产生效应这一假设的，适用于相似联合作用[9]，按照公式(6)来计算：

(6)

式中，ECx,i为混合物中i组分单独产生x%效应时的浓度；ECx,mix为产生效应x%的混合物浓度；Pi为i组分的浓度占混合物浓度的百分比；n为混合物组分数。

IA模型则适用于独立联合作用，即指混合物中各组分产生的效应独立于其他的，作用形式也不同[9]。其公式如下：

(7)

式中，E(Cmix)为包含n个组分的混合物在浓度为Cmix(Cmix=C1+,…,+Cn)时所产生的效应，E(Ci)为混合物中组分i在浓度为Ci时单独产生的效应。

CI模型采用如下公式计算[14]：

(8)

式中，CIxcomp为各个组分产生x%效应的联合指数，其按照公式(5)计算。

1.4.3 生态风险评价

为了评估抗生素在水体中对生态环境的不良影响，根据欧盟的技术指导文件(TGD)[29]采用危险商值(HQs)对潜在环境风险进行评价，HQs是通过预测或检测的环境浓度(PEC或MEC)与预测的无效浓度(PNEC)值进行计算的，运用公式(9)进行计算[9]：

(9)

其中PNEC是基于生物毒性实验来计算，表达式如下：

(10)

式中，EC50值采用本试验3种抗生素及其二元混合物对4种模式生物的中效值；AF(评价因子)为1 000(对于单营养级急性毒性试验)。

对于混合物的危险商值，多采用公式(11)计算[3]：

(11)

式中，HQi表示单一抗生素的危险商值。

1.5 数据统计和处理

采用SPSS 23和Origin 8.5对实验数据分别进行统计分析和作图，实验结果采用平均值±标准差(SD)表示。采用CalcuSyn软件求出药物单用和联用时的有关参数、联合指数(CI)。

2 结果与讨论(Results and discussion)

2.1 单一毒性及敏感性比较

用CalcuSyn软件计算出单一抗生素对模式生物的EC50值和95%置信限[9]，结果如表1所示。抗生素的毒性分级采用我国环境保护行业保护标准《新化学物质危害评估导则》[30](HJ/T 154—2004)：极高毒(EC50，≤1 mg·L-1)，高毒(EC50，1～10 mg·L-1)，中毒(EC50，10～100 mg·L-1)，低毒(EC50，>100 mg·L-1)。

由表1可知不同模式生物对同种抗生素敏感性不同(小球藻>斑马鱼胚胎>费氏弧菌>大型蚤)；不同抗生素同样对同种模式生物的毒性亦有差异，OTC对4种模式生物的毒性最大，其对小球藻极高毒；对于SMZ，费氏弧菌和大型蚤的EC50值分别为85.72 mg·L-1和188.00 mg·L-1，这与Kim等[31]报道的结果十分接近(78.1 mg·L-1和189.2 mg·L-1)；至于FF对非靶生物的生态毒理学研究甚少，李霞[32]对小球藻和隆线蚤进行急性毒性测试时发现FF对2种生物毒性分别表现为高毒和低毒，这与本文的研究结果一致；对于斑马鱼胚胎和大型蚤，测试抗生素均分别表现出中毒和低毒；至于费氏弧菌，SMZ和OTC表现出中毒，FF则表现出低毒，抗生素并未对费氏弧菌表现很强的毒性，Isidori等[33]解释为费氏弧菌短时间(5～30 min)暴露在药物的情况下，药物对其生物合成途径影响有限，选择24 h暴露时间毒性作用效果会更加明显。

2.2 联合毒性的评价及预测2.2.1 抗生素联合毒性相互作用

在得到抗生素单一和联合毒性数据的基础上，通过联合指数法来量化不同效应或浓度水平下抗生素之间的作用方式[34]。表2表示二元抗生素相互作用的剂量效应关系参数Dm即EC50、m、r值及不同效应水平下(EC10，EC50，EC90)联合指数CI平均值，联合指数CI与效应fa的关系如图1所示。

大体上，3种二元混合物组合对水生生物的毒性作用以拮抗效应为主。例如，OTC-FF组合在不同浓度下对4种模式生物均表现拮抗效应；丛永平等[35]也观测到相似的实验结果，OTC-FF二元混合物

表1 单一抗生素对4种模式生物的毒性终点值Table 1 Acute median effective concentrations of the test pharmaceuticals

注：SMZ、OTC、FF为磺胺甲恶唑、土霉素和氟苯尼考。

Note: SMZ, OTC, FF stand for sulfamethoxazole, oxytetracycline and florfenicol.

图1 二元抗生素组合的联合指数图注：SMZ-OTC(-■-)，SMZ-FF(-●-)，OTC-FF(-▲-)。Fig. 1 Combination index plot (fa-CI plot) for binary combinations of SMZ, OTC and FFNote: SMZ-OTC(-■-)，SMZ-FF(-●-)，OTC-FF(-▲-).

模式生物Model organism二元混合物Binary mixtures剂量反应参数Dose-response parameterCI值CI valuesEC50/(mg·L-1)mrEC10EC50EC90蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidosaSMZ-OTC9.010.500.966857.39Ant10.26Ant3.88AntSMZ-FF9.680.400.9780.06Syn1.01Add19.64AntOTC-FF3.110.200.8811.55Ant11.83Ant1 727.17Ant费氏弧菌Vibrio fischeriSMZ-OTC157.120.730.9901.06Add2.35Ant5.74AntSMZ-FF134.990.480.9780.90Add1.26Ant9.90AntOTC-FF123.880.660.9643.68Ant1.40Ant1.74Ant斑马鱼胚胎Zebrafish embryoSMZ-OTC54.541.240.9981.91Ant1.10Add0.64SynSMZ-FF129.371.040.9822.93Ant2.26Ant1.74AntOTC-FF137.811.030.9812.99Ant2.48Ant2.07Ant大型蚤Daphnia magnaSMZ-OTC140.361.330.9020.51Syn0.77Syn1.17AntSMZ-FF265.541.680.9740.96Add1.23Ant1.64AntOTC-FF221.691.450.95010.93Ant49.77Ant226.54Ant

注：协同、相加和拮抗作用分别用Syn, Add和Ant英文缩写表示。

Note: Syn, Add, Ant stand for synergism, additive effect and antagonism.

对明亮发光杆菌的毒性作用呈现拮抗效应。OTC与FF常作为主要渔药被使用，二者可能会因此在水体中共存对水生生物造成潜在危害。OTC与FF在DNA和RNA水平上具有相似的作用方式[36]，2种抗生素在不同阶段抑制细菌蛋白质的合成[37]，因此有研究将OTC与FF之间作用关系解释为协同或相加[38]；然而，当药物释放到水环境中时其作用于非靶标生物的作用机理可能会不同于靶生物[39]。联合指数仅仅只是量化了协同或拮抗效应，对于协同或拮抗作用机理的阐述是需要不同的方法去解决的单独问题[39]；例如，Fu等[40]用定量构效关系(QSAR)研究了OTC和FF对绿藻的作用机制。但是，目前还未有关于OTC与FF联合作用于非靶标生物的机理解释。此外，SMZ-OTC、SMZ-FF组合在对费氏弧菌和大型蚤的联合毒性效果上表现出一定的相似性，即在低效应情况下表现出协同或相加作用，高效应下表现出拮抗作用；这也说明联合毒性效果会随着效应水平的不同产生变化。

图2 二元抗生素混合物对4种模式生物的浓度-效应曲线和模型预测曲线Fig. 2 Experimental toxicity values (Exp) and predicted dose-response curves of the binary mixtures of the three chemicals based on concentration addition (CA), independent action (IA), and combination index (CI) models for the four aquatic organisms acute toxicity test

2.2.2 3种联合毒性预测模型的比较

应用CA、IA和CI这3个模型分别预测等毒性浓度比抗生素混合物对4种水生生物的联合毒性。混合物的观测浓度-效应散点图，CA、IA和CI预测的浓度-效应曲线均绘于图2，图2由上至下分别对应蛋白核小球藻、费氏弧菌、斑马鱼胚胎、大型蚤。

从图2可以看出，CI模型预测的数值大体上接近观测值。而当CI指数值与1偏差较大时，CA、CI模型的预测值与观测值均发生了明显的偏离，这说明组分之间发生了相互作用，高于观测值认为是拮抗作用，反之为协同作用[7]。当CI指数值与1接近时(相加作用)，如SMZ-OTC、SMZ-FF二元混合物对大型蚤的毒性作用，CA和IA模型也能较好地预测联合毒性相互作用；这也说明传统CA和IA模型适合预测药物不发生相互作用的相加作用，但在准确预测药物发生相互作用的联合毒性作用上有缺陷，而CI模型能够克服这一点[16,41]。

2.3 生态风险评价2.3.1 单一抗生素的最大生态风险评价

被选择的3种抗生素在上海地区河流和排放废水中检出含量如表3所示，图3表示上海地区不同水体中3种主要抗生素对4个不同营养级的水生生物(蛋白核小球藻、费氏弧菌、斑马鱼胚胎和大型蚤)的最大危险商值图(MEC取水体中最大抗生素浓度)。生态风险分为三级：当风险商值0.01≤HQ<0.1时意味着低度风险(low risk)；当0.1≤HQ<1.0时意味着中度风险(moderate risk)；当HQ≥1.0时意味着高度风险(high risk)[42]。

从图3可以看出，目标抗生素对蛋白核小球藻的危害性最大，而OTC最甚。相比之下，对于其他3种受试生物，除养殖废水处的风险程度表现出高度风险性外，其他3处水体均表现出低度风险或无风险。这表明除蛋白核小球藻外，其他水生生物所测试指标对目标抗生素的指示作用并不明显，但由于生物毒性蓄积作用，仍不能排除潜在风险。此外，也说明养殖废水的生态风险性远高于其他3处水体，原因可能是由于养殖户对抗生素的过量使用造成的，而目前我国对抗生素的使用没有明确的政策规定，因此使得未经代谢的残余抗生素直接排入水体而并未进行有效的处理，这导致养殖废水中抗生素含量偏高[4,18]；然而，养殖废水是抗生素污染的重要来源，目前国内外关于抗生素污染特征的研究偏重于河流、河口湾和污水处理厂等水环境，而对养殖区抗生素污染的生态风险评估较少[43]，这需要进一步的调查和数据统计。

2.3.2 三元抗生素混合物的生态风险评价

单一抗生素风险评价表明，蛋白核小球藻具有很好的风险指示作用，因此选用其对抗生素三元混合物进行生态风险评价。采用检出浓度的最大值、平均值和最小值来进行风险评价，这样更接近实际情况。抗生素混合物的危险商值图如图4所示，首先可以看出养殖废水对蛋白核小球藻具有极高风险，因为在检出浓度最小的情况下仍具有高风险，从表3看出这种风险居高不下主要是养殖废水中高浓度的OTC导致的。因此要降低养殖废水的生态风险影响必须对OTC进行处理后排放。此外，抗生素混合物在检出浓度平均值下的危险商值在长江口处接近0.1即中风险，在其他3处均表现出高风险。然而，这是未考虑抗生素相互作用下的风险情况；从图1可以看出SMZ-FF、OTC-FF组合在低剂量下对小球藻表现为协同作用或呈现该趋势。有研究表明二元混合物的相互作用主导了三元或多元混合物的作用方式[37,39]，因此二元混合物之间的协同作用可能会使得三元混合物生态风险进一步增加；目前，将非相加性相互作用数据用于生态风险评价的可行方法是“二元证据权法”(Binary Weight of Evidence)[48]。Marx等[49]应用该方法发现如果忽略抗生素之间的协同作用，会低估50%～200%的风险，这相当于联合指数CI从0.75到0.5所表现的协同效应。然而，该方法的主要限制是二元混合物转换到多元混合物的关键参数的不确定性[48]。

表3 上海地区水体中3种主要抗生素的检出浓度(ng·L-1)Table 3 The contamination level of three main antibiotics in the waters of Shanghai area (ng·L-1)

图3 基于上海地区水体中检出抗生素最大浓度计算出的危险商值图注：S1 黄浦江；S2 长江口；S3 养殖废水；S4 工厂废水。Fig. 3 Figure based on the calculated risk quotients for the three antibiotics in the waters of Shanghai areaNote: S1, Huangpu River; S2, Yangtze estuary; S3, Aquaculture wastewater; S4, Plant effluent.

图4 基于上海地区水体中检出抗生素浓度计算出的抗生素混合物危险商值图注：S1 黄浦江；S2 长江口；S3 养殖废水；S4 工厂废水。Fig. 4 Figure based on the calculated HQ for the mixture of three antibiotics in the waters of Shanghai areaNote: S1, Huangpu River; S2, Yangtze estuary; S3, Aquaculture wastewater; S4, Plant effluent.

综上所述：

(1)根据单一急性毒性测试结果，4种模式生物对抗生素的敏感性差异显著，敏感性：蛋白核小球藻>斑马鱼胚胎>费氏弧菌>大型蚤。目标抗生素中，OTC最具毒性，其对蛋白核小球藻具极高毒性。

(2)联合指数CI分析结果显示在效应EC10至EC90之间，二元混合药物之间多以拮抗作用为主；此外，随着抗生素浓度的变化，抗生素之间的作用效果亦随之变化；低浓度下，部分抗生素组合对模式生物表现出协同作用或趋势。通过与传统模型CA、IA的预测效果比较，发现CI模型更加贴近观测值，说明CI模型能准确预测抗生素混合物非相加性相互作用方式，并且通过CI指数量化作用程度。

(3)通过对上海不同水体中主要抗生素进行风险评价发现养殖废水对不同营养级的水生生物均有较高的风险性，这主要是养殖废水中OTC浓度过高所致；此外，相比其他营养级模式生物，蛋白核小球藻对不同水体均有很好的风险指示作用。并以小球藻作为指示生物进行抗生素混合物风险评价，结果显示在抗生素检出平均浓度下，长江口水体表现出中度风险，其他水体均表现出高度风险。如果考虑抗生素之间的相互作用，风险可能会继续升高。