龚 化，周治军，卢 童，徐 康，鲁 文

(1.湖北省天门市第一人民医院 泌尿外科，湖北 天门 431700；2.湖北省天门市第一人民医院 神经内科，湖北 天门 431700)

前列腺癌的发病率逐年升高，是男性泌尿、生殖系统最常见的恶性肿瘤之一[1]。转移是前列腺癌重要的生物学特性，多数患者确诊时已有远处转移，然而其转移的分子机制尚不清楚[2]。调节前列腺癌增殖、迁移相关基因的表达，抑制细胞的增殖和迁移，是前列腺癌靶向治疗研究的热点[3]。微小RNA(miRNA)是一类存在于真核生物体细胞中的内源性非编码RNA，可在转录水平抑制基因的表达，起着癌基因或抑癌基因的作用[4-5]。miR-148b-3p在多种肿瘤中呈低表达，发挥抑癌作用[6]。然而我们通过qPCR检测发现miR-148b-3p在多种前列腺癌细胞株中的表达均明显升高，miR-148b-3p在前列腺癌中的作用值得研究。本文通过将miR-148b-3p inhibitor转染至前列腺癌细胞PC-3，检测低表达miR-148b-3p对前列腺癌细胞PC-3增殖和迁移能力的影响，并探讨在基因及蛋白水平的作用机制，为前列腺癌的miRNA分子靶向治疗提供新的实验基础。

1 材料与方法

1.1 细胞株和主要试剂 RPMI-1640培养液、KSFM培养液和胎牛血清购自美国HyClone公司；前列腺癌细胞株LNCap、22RV1、DU-145、PC-3和人正常前列腺上皮细胞RWPE-1购自上海拜力生物科技有限公司；荧光实时定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；miR-148b-3p 抑制物(inhibitor)、阴性对照miR-NC、miR-148b-3p模拟物、野生型PTEN 3’UTR-荧光素酶载体(PTEN-Wt)和突变型PTEN 3’UTR-荧光素酶报告载体(PTEN-Mut)及PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成构建；Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；CCK8试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；Transwell小室购自美国Corning公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司；一抗PTEN、CDK6、Cyclin D2、Claudin-1、Vimentin、GAPDH和二抗均购于美国CST公司。

1.2 细胞培养和转染 用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液培养前列腺癌细胞LNCap、22RV1、DU-145和PC-3，用含10%FBS的KSFM培养液培养人正常前列腺上皮细胞RWPE-1，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱内常规培养。转染步骤参考Lipofectamine 2000说明书，以对数生长期的PC-3细胞进行转染操作，分别瞬时转染miR-NC(对照组)和miR-148b-3p inhibitor(实验组)。

1.3 qPCR检测miR-148b-3p和PTEN mRNA表达 用qPCR法检测前列腺癌细胞株(5株)及转染操作后两组细胞中miR-148b-3p和PTEN mRNA表达。用TRIzol法提取细胞总RNA，并使用反转录试剂盒反转录为cDNA。qPCR扩增条件为：95℃ 3min；95℃ 15s、58.8℃ 30s、72℃ 30s，35个循环，采用荧光实时定量PCR试剂盒进行qPCR检测，以GAPDH为内参，qPCR阈值Ct值以2-ΔΔCt分析处理。miR-148b-3p引物上游5’- GGATGTCAGTGCATCACAGAAC -3’，下游5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’。PTEN引物上游5’-TGGATTCGACTTAGACTTGACCT -3’，下游5’- GGTGGGTTATGGTCTTCAAAAGG -3’。GAPDH引物上游5’-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3’，下游5’- GCCATCACGCCACAGTTTC -3’。

1.4 CCK8法检测细胞增殖活性 转染48 h后，消化收集两组PC-3细胞，调整细胞密度，每孔以4×103个接种于96孔板。分别培养1、2、3、4、5 d后加入10 μL/孔 CCK8溶液，培养箱中孵育4 h，弃去培养液，加入150 μL/孔二甲基亚砜，振荡15 min，酶标仪测定每孔在490 nm波长的吸光度(OD值)，每组四个复孔。

1.5 Transwell 检测细胞迁移能力 转染48 h后，消化收集两组PC-3细胞，用无血清培养液制成单细胞悬液，上室中每孔接种细胞4×104个；下室加入含完全培养液，培养24 h。取出上室，棉签拭去未穿过膜的细胞，甲醇固定10 min，0.1%的结晶紫染色20 min，镜下观察，每孔取四个视野计细胞数，取平均值。

1.6 miR-148b-3p靶标基因预测及双荧光素酶报告基因检测实验验证 通过在线miRNA靶基因预测工具microRNA.org - Targets and Expression预测 miR-148b-3p的潜在靶点。分别将荧光素酶报告载体与miR-148b-3p模拟物或miR-NC按LipofectamineTM 2000说明书共转染至PC-3细胞。实验分组为PTEN-Wt+miR-NC、PTEN-Wt+miR-148b-3p、PTEN-Mut+miR-NC和PTEN-Mut+miR-148b-3p。转染4 h后换液，培养箱中培养48 h后收集细胞。按双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书，使用酶标仪仪检测细胞荧光素酶活性。相对荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶活性值/海肾荧光素酶活性值。

1.7 Western blot检测PTEN蛋白及相关蛋白表达 转染48 h后，消化收集两组PC-3细胞，使用细胞裂解液提取细胞总蛋白，每组取50 μg蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳后，转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温下封闭2 h，配制一抗PTEN(1∶1 000稀释)、CDK6(1∶2 000稀释)、Cyclin D2(1∶1 000稀释)、Claudin-1(1∶2 000稀释)、Vimentin(1∶1 500稀释)和GAPDH(1∶1 500稀释)，4 ℃下与一抗孵育过夜，室温下与二抗摇床上孵育2 h，ECL显影液曝光显影。

2 结果

2.1 前列腺癌细胞株中miR-148b-3p的表达 qPCR结果显示，前列腺癌细胞株LNCap、22RV1、DU-145、PC-3和人正常前列腺上皮细胞RWPE-1中miR-148b-3p的表达分别为3.29±0.24、2.35±0.20、4.35±0.19、6.03±0.57和1.05±0.19，各前列腺癌细胞株中miR-148b-3p的表达均高于正常前列腺上皮细胞，差异有统计学意义(P<0.01)，PC-3细胞中miR-148b-3p的表达最高(P<0.05，见图1)。

2.2 两组PC-3细胞中miR-148b-3p的表达 对照组和实验组PC-3细胞中miR-148b-3p相对表达量分别为1.02±0.12和0.37±0.11，实验组显著低于对照组(P<0.01)。

2.3 低表达miR-148b-3p对前列腺癌细胞增殖活性的影响 CCK8法结果显示：第3天，对照组和实验组PC-3细胞的吸光度OD值分别为1.12±0.10和0.81±0.05(P<0.05)；第4天，分别为1.75±0.09和1.18±0.09(P<0.01)；第5天，分别为2.53±0.19和1.57±0.13(P<0.01)。实验组明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05，见图2)。

2.4 低表达miR-148b-3p对前列腺癌细胞迁移能力的影响 Transwell 实验结果显示(见图3)，对照组和实验组PC-3细胞穿过多孔膜的细胞数分别为220.90±18.91和107.50±9.14，低表达miR-148b-3p的前列腺癌细胞穿膜能力明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。低表达miR-148b-3p的PC-3细胞的迁移能力受到抑制。

与对照组比较，**P<0.01。

2.5 生物信息学软件和双荧光素酶报告基因检测实验预测并验证PTEN是miR-148b-3p的靶基因 通过使用microRNA.org - Targets and Expression预测PTEN是miR-148b-3p的靶基因，miR-148b-3p的种子区域序列与PTEN3’端非编码区域(3’UTR)互补，结果如图4。miR-148b-3p模拟物明显抑制野生型PTEN-Wt报告载体的荧光素酶活性，与miR-NC相比下调66.26%(P<0.01)；而miR-148b-3p模拟物对突变型PTEN-Mut载体的荧光素酶活性无明显抑制作用(见图5)。实验结果表明，与生物信息学软件预测结果一致，miR-148b-3p能和PTEN的 3’UTR端结合。

2.6 两组PC-3细胞中PTEN mRNA的表达 qPCR结果显示，对照组和实验组PC-3细胞中PTEN mRNA相对表达量分别为1.03±0.13和4.10±1.15(P<0.01)。实验组PC-3细胞中PTEN mRNA的相对表达量显著高于对照组。

2.7 低表达miR-148b-3p对前列腺癌细胞PTEN蛋白及相关蛋白表达的影响 Western blott结果显示(见图6)，与对照组相比，实验组中PTEN和Claudin-1蛋白表达升高，CDK6、Cyclin D2和Vimentin蛋白表达降低，表明低表达miR-148b-3p具有诱导PTEN蛋白表达的作用。

1：PTEN-Wt+miR-NC；2：PTEN-Wt+miR-148b-3p；3：PTEN-Mut+miR-NC；4：PTEN-Mut+miR-148b-3p；与1相比，**P<0.01。

图6 Western blotting检测PTEN及相关蛋白表达情况

3 讨论

微小RNA(miRNA)通过在转录后水平降解或者干扰靶基因mRNA的翻译，抑制靶基因的表达，发挥调节肿瘤进展的作用，已成为近年来肿瘤研究的热点[7-9]。已有研究发现，miRNA 的表达异常与前列腺癌的进展密切相关[10]，如miR-33a、miR-331-3p、miR-129等具有抑制前列腺癌细胞增殖、转移的作用，表现为抑癌效应[11-13]；miR-210-3p、miR-20b等在前列腺癌组织中表达升高，发挥癌基因效应[14-16]。miR-148b-3p在多种肿瘤中呈现为低表达，负向调控肿瘤的生长和转移[6,17-18]，在前列腺癌中的作用及具体机制尚处于研究阶段。

本研究发现，miR-148b-3p在前列腺癌细胞株中的表达量高于人正常前列腺上皮细胞，尤其在PC-3细胞中较为突出，提示miR-148b-3p的高表达可能参与前列腺癌的进展；低表达miR-148b-3p的前列腺癌细胞其增殖和迁移能力降低，提示miR-148b-3p具有或参与抑制前列腺癌细胞增殖和迁移。PTEN是一种新发现的抑癌基因，位于10q23.3，具有磷酸酶活性，通过去磷酸化作用负向调控肿瘤细胞的恶性生物学行为[19]，在前列腺癌组织中呈低表达，与前列腺癌的恶性生物学行为呈负相关[20]。促进PTEN基因的表达，可能会抑制前列腺癌细胞的增殖和转移。通过生物信息学技术和双荧光素酶报告基因预测并验证了PTEN为miR-148b-3p的潜在靶基因，低表达miR-148b-3p可明显促进PTEN基因的表达， miR-148b-3p可能具有抑制PTEN基因表达的作用。Western blot实验进一步显示，低表达miR-148b-3p后，PTEN和Claudin-1蛋白的表达增加，CDK6、Cyclin D2和Vimentin蛋白的表达水平降低。Cyclin D2和CDK6均是细胞周期调控蛋白，二者通过形成复合物参与调控细胞周期的进展，诱导细胞DNA的合成，促进细胞的增殖[21]。低表达miR-148b-3p后，Cyclin D2-CDK6 复合物的形成减少，阻滞细胞周期，进而抑制PC-3细胞增殖。上皮间质转化(EMT)是前列腺癌细胞获得转移能力的重要机制，表现为上皮细胞表型如Claudin-1蛋白表达降低，间质表型Vimentin蛋白表达升高，细胞黏附力下降，细胞转移能力增强[22-23]。低表达miR-148b-3p后，Claudin-1蛋白的表达增加，Vimentin蛋白的表达降低，PC-3细胞的EMT被抑制，迁移能力降低。

总之，本研究表明miR-148b-3p在前列腺癌细胞株中呈高表达，低表达miR-148b-3p可抑制前列腺癌PC-3细胞的增殖和迁移能力，作用机制可能为miR-148b-3p的低表达导致PTEN的表达抑制被解除，最终抑制前列腺癌细胞的增殖和迁移。