耿娜娜，李学英，郑 翔，杨 蕾，吴明松

(1.遵义医学院 贵州省普通高等学校口腔疾病研究特色重点实验室暨遵义市口腔疾病研究重点实验室，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院 贵州省普通高等学校微生物资源及药物开发特色重点实验室，贵州 遵义 563099；3.遵义医学院 口腔医学院，贵州 遵义 563099；4.遵义医学院 医学遗传学教研室，贵州 遵义 563099)

肺癌(lung cancer)是全世界癌症患者死亡的主要原因。其发病率和死亡率均位居我国恶性肿瘤的首位[1]。对于早期实体肿瘤，手术切除是首选方案；但对于晚期癌症患者，多采用化学治疗[2]。顺铂(cis-dichlorodiamine platinum，CDDP)是临床治疗肺癌的一线药物，但其具有较强的毒副作用，且随着癌细胞耐药性的增加，使得CDDP的临床应用受到一定限制。细胞恶性增殖是癌细胞的显著特征之一，因此，寻找一种既能够抑制肺癌细胞增殖，又能够降低CDDP剂量的辅助性药物，具有重要意义。真菌产生的次生代谢产物被认为是研发抗癌药物的重要来源[3]。布雷菲德菌素A(Brefeldin A，BFA)是真菌产生的一种大环内酯类抗生素，具有抗菌、抗癌等多种活性[4]。研究表明，BFA对前列腺癌、卵巢癌和乳腺癌等均有抑制增殖和促凋亡作用[5-7]。本课题组前期研究表明，BFA可协同CDDP抑制肺癌GLC-82细胞生长、诱导细胞凋亡发生，且与内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)途径中PERK-ATF4和IRE1-XBP1通路的激活有关[8-10]，但二者的协同作用，是否也与ERS分子标志物葡萄糖调节蛋白94(gloucose regulated protein 94，GRP94)及其主要通路之一转录活化因子6(activating transcription factor 6，ATF6)通路的激活有关，尚未阐明。因此，本研究探讨了ATF6通路标志性分子ATF6和ATF6B在BFA协同CDDP抑制肺癌细胞增殖中的作用，为肺癌的临床治疗方案提供更多的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 人肺癌GLC-82细胞系由中国科学院昆明动物所曹毅研究员惠赠。

BFA购自Cell Signaling Technology公司，顺铂注射液购自山东齐鲁制药公司，RPMI-1640培养基购自Gibco公司，胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司，PCR引物和dNTP Mix(10mM)购自上海生工生物公司，M-MLV逆转录酶和RNase抑制剂购自Promega公司，RNAiso TM Plus购自TaKaRa Biotechnology公司，q-RT-PCR试剂盒购自Bio-Rad公司，兔抗人β-actin单抗、鼠抗人GRP94单抗、兔抗人多抗ATF6和ATF6B及二抗均购自Protein-Tech Group公司，CCK8试剂盒购自Solarbio公司。

二氧化碳培养箱(GOLD-SIM)购自西盟国际公司，酶标仪(Model 680)、PCR仪(CFX Connect TM Optics Module)、电泳仪(PowerPac Basic)及凝胶成像系统(Gel Doc XR)均购自Bio-Rad公司。

1.2 人肺癌GLC-82细胞培养 人肺癌GLC-82细胞培养于RPMI-1640培养基中，培养基中含10 %胎牛血清、2.0 g/L NaHCO3、100 μg/mL链霉素及100 U/mL青霉素，将细胞置于37 ℃、5 % CO2、饱和湿度的培养箱中培养，每2～3天传代1次。

1.3 CCK8法检测GLC-82细胞增殖抑制率 取对数期细胞，以5×104个/mL的密度接种于96孔培养板中，静置培养24 h后，分别设置50 ng/mL BFA组、2 μg/mL CDDP组及50 ng/mL BFA+2 μg/mL CDDP组作为实验组，同时设置加入等体积二甲基亚砜的对照组。静置培养24 h后，按CCK-8试剂盒说明书方法检测细胞活力，用酶标仪测定450 nm波长处的吸光值(OD值)，对照组细胞增殖抑制率记为0，计算药物对细胞生长增殖的抑制率。

1.4 检测 GRP94、ATF6的mRNA水平 药物处理24 h和48 h后，用RNAiso TM Plus裂解细胞、提取总RNA，按逆转录试剂盒方法合成cDNA。PCR引物：β-actin，上游:5′- CGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游:5′-CAGGAAGGAAGGCTGGAAG-3′；GRP94，上游:5′-CTGGGACTGGGAACTTATGAATG-3′,下游:5′-TCCATATTCGTCAAACAGACCAC-3′；ATF6，上游:5′-TCCTCGGTCAGTGGACTCTTA-3′，下游:5′-CTTGGGCTGAATTGAAGGTTTTG-3′。将cDNA按1∶10稀释后作为模板，建立反应体系：总体积10 μL，包括1 μL cDNA，5 μL Sso Fast Eva Green supermix，0.5 μL 3′引物，0.5 μL 5′引物，3 μL无菌水。PCR反应程序为：94 ℃ 60 s，95 ℃ 20 s，56 ℃(β-actin)或63.5 ℃(GRP94)或62.4 ℃(ATF6)30 s，40个循环周期。以β-actin为内参，采用2-△△CT方法计算基因的相对表达量。

1.5 检测 GRP94、ATF6和ATF6B蛋白水平 药物处理24 h和48 h后，裂解细胞提取其总蛋白质，采用BCA法进行蛋白质定量，取一定量的蛋白样品，进行蛋白变性、上样、电泳、转膜、脱脂牛奶封闭、孵育一抗(GRP94 1∶2 000；ATF6 1∶3 000；ATF6B 1∶1 000；β-actin 1∶10 000)、孵育二抗(1∶2 000)、曝光、显影、晾干、拍照，采用IPP软件分析条带的灰度值。

2 结果

2.1 BFA 协同CDDP抑制GLC-82细胞的增殖 CCK8实验结果显示，药物处理24 h后，BFA组、CDDP组和联合用药组细胞增殖抑制率分别为(28.6±6.8)%、(24.0±9.6)%和(57.1±3.1)%，均显著高于对照组(P<0.01、P<0.01、P<0.01)，且联合用药组细胞增殖抑制率亦显著高于BFA组和CDDP组(P<0.01、P<0.01)(见图1)。

**表示与对照组相比，P<0.01；##表示与联合用药组相比，P<0.01。对照组细胞增殖抑制率记为0。

2.2 BFA 与CDDP对细胞内质网应激分子GRP94表达的影响 GRP94是内质网应激标志性分子之一[11]，本研究结果显示，与对照组相比，BFA 与CDDP联合处理24 h后，联合用药组细胞GRP94 mRNA水平上调(19.9±2.8)倍(P<0.01)(见图2)，蛋白质水平上调(1.3±0.4)倍(P<0.01)(见图3)；药物处理48 h后，联合用药组GRP94 mRNA水平上调(10.5±0.7)倍(P<0.01，见图2)，意外的是，蛋白质水平下调(4.5±1.7)倍(P<0.01，见图3)。

**表示与对照组相比，P<0.01；##表示与联合用药组相比，P<0.01。

*和**表示与对照组相比，P<0.05和P<0.01；#和##表示与联合用药组相比，P<0.05和P<0.01。

2.3 BFA 与CDDP对细胞ATF6表达的影响 ATF6有ATF6和ATF6B两种亚型，本研究结果显示，与对照组相比，药物处理24 h后，BFA 与CDDP联合用药组肺癌细胞ATF6 mRNA水平上调(22.9±4.7)倍(P<0.01)(见图4)，蛋白质水平上调(6.1±1.8)倍(P<0.01，见图5)。药物处理48 h后，联合用药组细胞ATF6 mRNA水平上调(12.1±1.8)倍(P<0.01，见图4)，蛋白质水平上调(1.4±0.3)倍(见图5)。

**表示与对照组相比，P<0.01；#和##表示与联合用药组相比，P<0.05和P<0.01。

2.4 BFA 与CDDP联用增强肺癌细胞ATF6B的表达 Western Blot结果显示，与对照组相比，药物处理24 h后，BFA 与CDDP联用后，GLC-82细胞ATF6B蛋白质水平上升(5.7±1.8)倍(P<0.01)。但48 h后，其上升趋势有所下降，联合用药组ATF6B蛋白质水平上调(2.6±0.9)倍(P<0.01，见图6)。

**表示与对照组相比，P<0.01；#和##表示与联合用药组相比，P<0.05和P<0.01。

**表示与对照组相比，P<0.01；##表示与联合用药组相比，P<0.01。

3 讨论

内质网(endoplasmic reticulum，ER)是真核细胞中重要的细胞器，主要进行蛋白质合成、折叠、聚集等，也是细胞内重要的Ca2+储存场所[12]。ER内环境的稳定是维持细胞和机体正常生理功能的关键。多种生理性或病理性干扰因素，如缺氧、缺血、营养不良、Ca2+代谢失衡、氧化还原失衡、毒素刺激、炎症、细胞自噬等均能够干扰ER的稳态，导致未折叠或错误折叠蛋白在内质网腔中积累、聚集，最终导致ER稳态平衡的丧失，引发内质网应激。为了提高ER对蛋白折叠加工的能力，应对ERS诱发的细胞凋亡等不利影响，细胞可通过激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)来恢复ER稳态及正常功能，从而促进细胞存活[13]。目前已知的UPR信号转导过程主要是由ER的三种跨膜蛋白所启动，即蛋白激酶样内质网激酶(protein kinase R like endoplasmic reticulum kinase，PERK)、激活转录因子(activating transcription factor 6，ATF6)及肌醇需求酶1(inositol requiring enzyme-1，IRE1)[14]。正常情况下，PERK、ATF6和IRE1与ER的分子伴侣葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)紧密结合形成稳定的复合体，均处于无活性状态；当发生ERS时，ER腔中积累的未折叠或错误折叠蛋白优先与GRP78结合，导致3种跨膜蛋白与GRP78发生解离而被激活，从而触发UPR信号通路，并影响下游分子及相关基因的表达[15]。研究表明，ERS与UPR在很多肿瘤(如肝癌、胃肠道肿瘤、乳腺癌等)的发生、发展中具有十分重要的作用，对肿瘤细胞存活、侵袭、转移、肿瘤血管生成和肿瘤细胞凋亡等方面[16-17]。

葡萄糖调节蛋白94(glucose-regulated protein 94，GRP94)是热休克蛋白90(heat shock protein，HSP90)家族的成员之一，主要位于内质网腔中，是一种高度保守的内质网丰度蛋白和驻留糖蛋白，与HSP90具有50%的同源性[11]。GRP94作为分子伴侣，一方面参与到蛋白质的折叠、加工、转运和分泌过程，另一方面参与了肿瘤特异性抗原的提呈，以启动细胞特异性免疫反应。与内质网中蛋白质二硫键异构酶、GRP78蛋白及钙网织蛋白不同，GRP94能够与Ca2+结合，参与寡聚体的组装、分解，抑制错误蛋白质的分泌过程。研究证实，GRP94与肿瘤的发生发展过程密切相关[18]。GRP94的高表达能够增加肺癌NCI-H460细胞对CDDP的化疗敏感性[19]。本研究结果显示，BFA与CDDP协同可显著抑制肺癌GLC-82细胞的增殖作用，在联合用药24 h时，BFA协同CDDP增加了细胞GRP94分子的表达水平，从而增加了二者抑制肺癌细胞增殖的能力；而在联合用药48 h时，细胞已发生不可逆转的损伤，细胞对外界的应激能力减弱，导致诸如应激等伴侣蛋白，如GRP94等水平表达受到一定程度的抑制。这与许多报道一致，即适当的ERS促进细胞存活，而过度的ERS则抑制细胞生长增殖[20]。

ATF6位于ER膜的胞质侧，在哺乳动物细胞中具有ATF6(ATF6α)和ATFB(ATF6β) 两种亚型。当ERS发生时，ATF6与GRP78解离，与衣被蛋白Ⅱ(coat protein，COPⅡ)结合后移位至高尔基体中，依次被位点1蛋白酶(S1P)和位点2蛋白酶(S2P)水解，释放只含有N末端胞质结构域的p50活性片段，其移位至胞核内与ERS反应元件(endoplasmic reticulum stress element，ERSE)相互结合，激活ERS相关分子如GRP94、XBP1、ERP72和CHOP 等的转录[21]，增加ER的蛋白折叠容量。ATF6在UPR中具有十分重要的作用，被认为是ERS的一个重要靶点[22]。已有研究表明，在结肠癌组织中ATF6的表达水平显著下调，表明其在结肠癌的发生发展中发挥一定的作用[23]。当肾小球足细胞内ATF6的表达被沉默后，棕榈酸对足细胞增殖的抑制作用明显减弱。本研究结果显示，正常对照组肺癌GLC-82细胞处于低应激状态，ATF6和ATF6B的表达水平较低，与上述研究结果一致；而经BFA与CDDP联合处理后，细胞应激水平升高， ATF6通路被激活，表现为ATF6和ATF6B的表达水平上调。因此，BFA协同增强CDDP抑制GLC-82细胞增殖的机制之一可能是BFA与CDDP联合用药促进细胞ATF6和ATF6B的表达水平上调，耗竭了GRP94等维护细胞稳态的分子，细胞无法通过ERS维持稳态、停止增殖，最终死亡。

综上所述，BFA协同增强CDDP抑制肺癌GLC-82细胞增殖的作用与ATF6通路和GRP94分子的激活密切相关，为肺癌的分子靶向治疗和临床治疗方案提供了新的探索。