陈宇堃 陈华 梁蔚阳

中圖分类号 R927.1 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）18-2509-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.18.15

摘 要 目的：改进测定门冬氨酸鸟氨酸原料药中有关物质的方法。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为Phenomenex Luna NH2（两根串联），流动相为0.02 mol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH 5.6）-乙腈（40 ∶ 60，V/V），流速为1.0 mL/min，检测波长为205 nm，柱温为35 ℃，进样量为20 μL。结果：马来酸、3-氨基-2-哌啶酮、琥珀酸、苹果酸、富马酸、β-门冬氨酰门冬氨酸检测质量浓度线性范围分别为5.398～26.992 ?g/mL（r=0.999 1）、5.204～26.021 ?g/mL（r=0.999 3）、5.149～25.749 ?g/mL（r=0.999 6）、5.174～25.874 ?g/mL（r=0.999 3）、5.164～25.823 ?g/mL（r=0.999 3）、5.194～25.973 ?g/mL（r=0.999 5）；定量限分别为0.22、0.53、51.50、103.50、0.26、8.31 ng，检出限分别为0.13、0.26、10.30、20.70、0.13、2.08 ng；精密度、稳定性、重复性试验的RSD均不超过2%；加样回收率分别为99.30%～102.31%（RSD=1.02%，n=9）、99.88%～100.89%（RSD=0.37%，n=9）、99.36%～101.53%（RSD=0.70%，n=9）、99.13%～102.65%（RSD=1.15%，n=9）、100.18%～101.45%（RSD=0.38%，n=9）、99.39%～100.81%（RSD=0.58%，n=9）。6批样品均未检出马来酸、琥珀酸和β-门冬氨酰门冬氨酸；3-氨基-2-哌啶酮含量为0.006%～0.056%，苹果酸含量为0.014%～0.071%，富马酸含量为0.000 5%～0.003 4%，最大未知杂质含量为0.013%～0.110%，未知杂质总含量为0.013%～0.120%。结论：该方法操作简便，精密度、稳定性、重复性均较好，可用于门冬氨酸鸟氨酸原料药中有关物质的测定。

关键词 门冬氨酸鸟氨酸；高效液相色谱法；马来酸；3-氨基-2-哌啶酮；琥珀酸；苹果酸；富马酸；β-门冬氨酰门冬氨酸；有关物质

ABSTRACT OBJECTIVE： To improve the determination method of related substances in ornithine aspartate raw material. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Phenomenex Luna NH2 column （two series- connected） with mobile phase consisted of 0.02 mol/L potassium dihydrogen phosphate buffer solution （pH 5.6）-acetonitrile （40 ∶ 60， V/V） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 205 nm， and column temperature was 35 ℃. The sample size was 20 μL. RESULTS： The linear range of maleic acid， 3-amino-2-piperidinone， succinic acid， malic acid， fumaric acid and β-aspartyl-aspartic acid were 5.398-26.992 ?g/mL（r=0.999 1）， 5.204-26.021 ?g/mL（r=0.999 3）， 5.149-25.749 ?g/mL （r=0.999 6）， 5.174-25.874 ?g/mL（r=0.999 3）， 5.164-25.823 ?g/mL（r=0.999 3）， 5.194-25.973 ?g/mL（r=0.999 5）. The limits of quantitation were 0.22， 0.53， 51.50， 103.50， 0.26 and 8.31 ng； the limits of detection were 0.13， 0.26， 10.30， 20.70， 0.13 and 2.08 ng. RSDs of precision， stability， and reproducibility tests were no more than 2%. The average recoveries were 99.30%-102.31%（RSD=1.02%，n=9）， 99.88%-100.89%（RSD=0.37%，n=9）， 99.36%-101.53%（RSD=0.70%，n=9）， 99.13%-102.65%（RSD=1.15%，n=9）， 100.18%-101.45%（RSD=0.38%，n=9）， 99.39%-100.81%（RSD=0.58%，n=9）. Neither maleic acid， succinic acid and β-aspartyl-aspartic acid were found in 6 batches of samples. The contents of 3-amino-2-piperidinone were 0.006%-0.056%； the contents of malic acid were 0.014%-0.071%； the contents of fumaric acid were 0.000 5%-0.003 4%； the contents of maximal unknown impurity were 0.013%-0.110%； total contents of unknown impurity were 0.013%-0.120%. CONCLUSIONS： The method is simple， precise， stable and reproducible， and can be used for the determination of the related substances in ornithine aspartate raw material.

KEYWORDS Ornithine aspartate； HPLC； Maleic acid； 3-amino-2-piperidinone； Succinic acid； Malic acid； Fumaric acid； β-aspartyl-aspartic acid； Related substance

门冬氨酸鸟氨酸由德国麦氏大药厂于20世纪60年代研发成功，其注射液于70年代应用于临床。该药于1991年收载入《德国药典》[1]，同时被美国FDA批准用于治疗肝性脑病[2]。在2014年《美国肝病协会和欧洲肝病协会慢性肝炎致肝性脑病实践指南》中，门冬氨酸鸟氨酸被推荐用于肝性脑病的治疗[3]。谷氨酰胺是氨的解毒产物，也是氨的储存与运输形式；氨的主要代谢途径是在肝脏中通过尿素循环合成尿素而排出体外。在正常生理和病理条件下，尿素及谷氨酰胺的合成会受到鸟氨酸和其他二羧基化合物的影响。门冬氨酸鸟氨酸进入血液后可分解为鸟氨酸和门冬氨酸。鸟氨酸可激活尿素合成过程中的鸟氨酸氨基甲酰转移酶和氨基甲酰磷酸合成酶，并通过肝脏中的鸟氨酸循环来加速尿素合成，促进氨的代谢，迅速降低血氨水平，由此可促进肝细胞自身的修复和再生，从而有效地改善肝功能，以恢复机体的能量平衡[4-5]。门冬氨酸可参与肝细胞内核酸的合成，促进损伤肝细胞的修复，并可间接参与肝细胞内三羧酸循环，提供能量代谢的中间产物，从而增强肝脏功能[5]。国外研究发现，门冬氨酸能够激活N-甲基-D-门冬氨酸（NMDA）受体，使β-arrestin-2信号分子活性增强，调节G蛋白偶联受体（GPCRs），抑制核转录因子κB（NF-κB）活性，从而减轻肝脏炎性反应，改善肝脏炎性病变[6]。近年来研究表明，门冬氨酸鸟氨酸在治疗肝性脑病、脂肪性肝病、病毒性肝炎、肝硬化和藥物性肝损伤等方面均有明显疗效[7]。

2015年版《中国药典》（二部）采用高效液相色谱法（HPLC），以氨基键合硅胶为色谱柱填充剂、0.02 mol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH 5.6）-乙腈（40 ∶ 60，V/V）为流动相对门冬氨酸鸟氨酸原料药中5种已知杂质[马来酸、富马酸、精氨酸、3-氨基-2-哌啶酮和门冬氨酸缩合物（β-门冬氨酰门冬氨酸）]进行含量测定，并利用自身对照法测定未知杂质的含量[8]。笔者在试验中发现，在该色谱条件下，溶剂峰与马来酸峰存在重叠情况；精氨酸峰响应值较低，灵敏度不高；自身对照溶液的门冬氨酸鸟氨酸质量浓度为4 μg/mL，该浓度下鸟氨酸峰响应值较低。《美国药典》（40版）收载的门冬氨酸标准中除规定马来酸和富马酸的限度分别为0.05%和0.10%外，还规定了苹果酸的限度为0.20%[9]；另外，琥珀酸亦为门冬氨酸生产过程中的副产物。因此，有必要对2015年版《中国药典》（二部）中的色谱条件进行改进，并增加对苹果酸、琥珀酸的含量测定。而目前尚未见文献报道同时测定门冬氨酸鸟氨酸原料药中马来酸、3-氨基-2-哌啶酮、琥珀酸、苹果酸、富马酸、β-门冬氨酰门冬氨酸含量的方法。因此，本研究参考2015年版《中国药典》（二部）门冬氨酸鸟氨酸原料药中有关物质测定的色谱条件[8]，以两根氨基色谱柱串联的方式，建立了同时测定门冬氨酸鸟氨酸原料药中上述6种已知杂质含量的方法，以为其质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

E2695型HPLC仪，包括紫外检测器、Empower 3数据处理软件等（美国Waters公司）；MS205DU型十万分之一电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；PB-10型pH计（德国Sartorius公司）。

1.2 药品与试剂

门冬氨酸鸟氨酸原料药（生产企业1，批号：17371、17372、17373，纯度：99.9%、100.2%、100.1%；生产企业2，批号：67911、67912、67913，纯度：100.0%、100.6%、100.1%）；门冬氨酸鸟氨酸对照品（日本协和发酵生化株式会社，批号：163561，纯度：99.7%）；3-氨基-2-哌啶酮对照品（东京化成工业株式会社，批号：P1195896，纯度：98.1%）；马来酸对照品（批号：LKK1196，纯度：99.6%）、琥珀酸对照品（批号：LKM6297，纯度：99.9%）、苹果酸对照品（批号：LKH3957，纯度：99.9%）、富马酸对照品（批号：LKL0807，纯度：99.8%）均由日本和光纯药工业株式会社提供；β-门冬氨酰门冬氨酸对照品（上海柯维化学技术有限公司，批号：DH110298，纯度：98.2%）；乙腈为色谱纯，磷酸二氢钾、浓氨溶液均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex Luna NH2（150 mm×4.6 mm，3 μm），两根串联；流动相：0.02 mol/L磷酸二氢钾缓冲液（取磷酸二氢钾2.72 g，加水500 mL溶解，加浓氨溶液5 mL，用水稀释至1 000 mL，用磷酸调节pH至5.6）-乙腈（40 ∶ 60，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：205 nm；进样量：20 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 稀释液 以0.02 mol/L磷酸二氢钾缓冲液（取磷酸二氢钾2.72 g，加水500 mL溶解，加浓氨溶液5 mL，用水稀释至1 000 mL，用磷酸调节pH至5.6）-乙腈（60 ∶ 40， V/V）为稀释液。

2.2.2 系统适用性试验用混合对照品溶液 分别精密称取门冬氨酸鸟氨酸、马来酸、3-氨基-2-哌啶酮、琥珀酸、苹果酸、富马酸、β-门冬氨酰门冬氨酸对照品各适量，加入“2.2.1”项下稀释液溶解，制成每1 mL中含门冬氨酸鸟氨酸10 mg和马来酸、3-氨基-2-哌啶酮、琥珀酸、苹果酸、富马酸、β-门冬氨酰门冬氨酸各10 μg的系统适用性试验用混合对照品溶液。

2.2.3 混合对照品贮备液 分别精密称取马来酸、3-氨基-2-哌啶酮、琥珀酸、苹果酸、富马酸、β-门冬氨酰门冬氨酸对照品各适量，加入“2.2.1”项下稀释液溶解，制成每1 mL中含马来酸、3-氨基-2-哌啶酮、琥珀酸、苹果酸、富马酸、β-门冬氨酰门冬氨酸各0.5 mg的混合对照品贮备液。

2.2.4 混合对照品溶液 精密量取“2.2.3”项下混合对照品贮备液适量，加入“2.2.1”项下稀释液制成每1 mL中含马来酸、3-氨基-2-哌啶酮、琥珀酸、苹果酸、富马酸、β-门冬氨酰门冬氨酸各10 μg的混合对照品溶液。

2.2.5 供试品溶液 精密称取样品适量，加入“2.2.1”项下稀释液溶解，制成每1 mL中含门冬氨酸鸟氨酸10 mg的供试品溶液。

2.2.6 对照溶液 精密量取“2.2.5”项下供试品溶液适量，加入“2.2.1”项下稀释液制成每1 mL中含门冬氨酸鸟氨酸10 μg的对照溶液。

2.2.7 阴性对照溶液 以“2.2.1”项下稀释液为阴性对照溶液。

2.3 系统适用性试验

取“2.2”项下系统适用性试验用混合对照品溶液、混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，详见图1。由图1可知，各成分均能达到基线分离，溶剂、马来酸、3-氨基-2-哌啶酮、门冬氨酸、琥珀酸、苹果酸、富马酸、鸟氨酸、β-门冬氨酰门冬氨酸峰的分离度均大于1.58；马来酸、3-氨基-2-哌啶酮、门冬氨酸、琥珀酸、苹果酸、富马酸、鸟氨酸、β-门冬氨酰门冬氨酸峰的理论板数均不小于6 237。

2.4 破坏性试验

2.4.1 未破坏样品溶液 取样品100 mg，置于10 mL量瓶中，加入“2.2.1”項下稀释液溶解并稀释至刻度，制成每1 mL中含门冬氨酸鸟氨酸10 mg的溶液。

2.4.2 酸破坏样品溶液 取样品100 mg，置于10 mL量瓶中，加入2 mol/L盐酸溶液2 mL，放置30 min后，加入2 mol/L氢氧化钠溶液2 mL中和，加入“2.2.1”项下稀释液溶解并稀释至刻度，制成每1 mL中含门冬氨酸鸟氨酸10 mg的溶液。

2.4.3 碱破坏样品溶液 取样品100 mg，置于10 mL量瓶中，加入2 mol/L氢氧化钠溶液2 mL，放置30 min后，加入2 mol/L盐酸溶液2 mL中和，加入“2.2.1”项下稀释液溶解并稀释至刻度，制成每1 mL中含门冬氨酸鸟氨酸10 mg的溶液。

2.4.4 氧化破坏样品溶液 取样品100 mg，置于10 mL量瓶中，加入30%过氧化氢溶液2 mL，放置30 min后，加入“2.2.1”项下稀释液溶解并稀释至刻度，制成每1 mL中含门冬氨酸鸟氨酸10 mg的溶液。

2.4.5 高温破坏（固体）样品溶液 取样品适量，置于120 ℃下放置5 d，精密称取100 mg，置于10 mL量瓶中，加入“2.2.1”项下稀释液溶解并稀释至刻度，制成每1 mL中含门冬氨酸鸟氨酸10 mg的溶液。

2.4.6 光照破坏样品溶液 取样品适量，置于4 500 lx光照下20 d，精密称取100 mg，置于10 mL量瓶中，加入“2.2.1”项下稀释液溶解并稀释至刻度，制成每1 mL中含门冬氨酸鸟氨酸10 mg的溶液。

2.4.7 高温破坏（液体）样品溶液 取样品100 mg，置于10 mL量瓶中，加入少量“2.2.1”项下稀释液溶解，沸水浴中加热30 min，加入“2.2.1”项下稀释液稀释至刻度，制成每1 mL中含门冬氨酸鸟氨酸10 mg的溶液。

取上述各样品溶液20 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，详见图2。由图2可知，在上述试验条件下，产生的所有降解产物峰均能与主成分峰实现有效分离，在高温破坏（固体）条件下可产生3-氨基-2-哌啶酮，在酸破坏和碱破坏条件下可产生苹果酸，在高温破坏（液体）条件下可产生3-氨基-2-哌啶酮和富马酸，在氧化破坏条件下可产生琥珀酸。

2.5 线性关系考察

精密量取“2.2.3”项下混合对照品贮备液0.5、0.7、1、2、2.5 mL，分别置于50 mL量瓶中，加入“2.2.1”项下稀释液稀释至刻度，取适量按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以各待测成分质量浓度（x，?g/mL）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，回归方程与线性范围见表1。

2.6 定量限与检出限考察

分别精密量取“2.2.4”项下混合对照品溶液适量，倍比稀释，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分别计算定量限、检出限。结果，马来酸、3-氨基-2-哌啶酮、琥珀酸、苹果酸、富马酸、β-门冬氨酰门冬氨酸的定量限分别为0.22、0.53、51.50、103.50、0.26、8.31 ng，检出限分别为0.13、0.26、10.30、20.70、0.13、2.08 ng。

2.7 精密度试验

取“2.2.4”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，马来酸、3-氨基-2-哌啶酮、琥珀酸、苹果酸、富马酸、β-门冬氨酰门冬氨酸峰面积的RSD分别为0.1%、0.3%、0.9%、0.7%、0.3%、1.1%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验

取“2.2.5”项下供试品溶液（批号：17371）适量，分别于室温下放置0、1、2、4、8 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，3-氨基-2-哌啶酮、苹果酸、富马酸峰面积的RSD分别为1.01%、1.35%、1.56%（n=5），其他成分未检出，表明供试品溶液在室温下放置8 h内基本稳定。

2.9 重复性试验

精密称取样品（批号：17371）适量，共12份，分别按“2.2.5”及“2.2.6”项下方法制备供试品溶液和对照溶液各6份，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品中各杂质的含量。结果，3-氨基-2-哌啶酮、苹果酸、富马酸、最大未知杂质、未知杂质总量的平均含量分别为0.053%、0.061%、0.003 3%、0.097%、0.118%，RSD分别为0.5%、1.5%、0.9%、1.5%、2.0%（n=6），其他成分未检出，表明本方法重复性良好。

2.10 加样回收率試验

取已知含量的样品（批号：17371）约0.2 g，精密称定，共9份，分别置于20 mL量瓶中，加入一定量的混合对照品贮备液，加入“2.2.1”项下稀释液稀释至刻度，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表2。

2.11 样品有关物质测定

取各批样品适量，分别按“2.2.5”及“2.2.6”项下方法制备供试品溶液和对照溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，平行测定3次，记录峰面积并按外标法计算样品中各已知杂质的含量，以自身对照法计算最大未知杂质与未知杂质总量，结果见表3。

2.12 不同方法测定样品有关物质的比较

采用本研究方法与2015年版《中国药典》（二部）方法，分别测定各批样品中各杂质的含量，结果见表4、表5。结果表明，本研究方法测定的3-氨基-2-哌啶酮、富马酸的含量与2015年版《中国药典》（二部）方法的测定结果相近，而本研究所用方法可检出苹果酸的含量。

3 讨论

3.1 杂质来源

门冬氨酸鸟氨酸是以门冬氨酸与盐酸鸟氨酸为原料，经成盐等工序合成制得[10]。门冬氨酸以富马酸为原料，可经蛋白酶催化及纯化等过程制备[11]。马来酸为富马酸的顺式异构体，而苹果酸和琥珀酸为富马酸在生产反应中产生的副产物。门冬氨酸在制备或存放过程中可能会发生氨基酸脱水缩合反应，生成β-门冬氨酰门冬氨酸。亦有文献报道，采用化学合成法，利用马来酸酐和氨水为主要原料合成门冬氨酸，其生产过程中会产生马来酸[12]。鸟氨酸在存放过程中会产生自身缩合物3-氨基-2-哌啶酮。故本试验选择马来酸、3-氨基-2-哌啶酮、琥珀酸、苹果酸、富马酸、β-门冬氨酰门冬氨酸6种杂质进行含量测定。

3.2 杂质结构与名称

2015年版《中国药典》（二部）收载的门冬氨酸鸟氨酸原料药中杂质Ⅱ为门冬氨酸缩合物[8]。门冬氨酸含有2个羧基和1个氨基，根据其结构式和氨基酸脱水缩合反应原理推测，发生脱水缩合反应时应有2种构型，分别为α-门冬氨酰门冬氨酸（物质数字识别号码：58471-53- 7）和β-门冬氨酰门冬氨酸（物质数字识别号码：60079- 22-3）。根据2015年版《中国药典》（二部）收载的门冬氨酸鸟氨酸原料药杂质Ⅱ的结构式推测为β-门冬氨酰门冬氨酸。

3.3 流动相的选择

本研究采用氨基键合硅胶为色谱柱填充剂，以0.02 mol/L磷酸二氢钾缓冲液[不同pH（5.6、6.3、6.25、6.2、6.15）]-乙腈（40 ∶ 60，V/V）为流动相进行试验，发现流动相的pH值对出峰顺序及峰形影响较大，其pH值变化会使各物质的出峰顺序、时间和峰形产生明显变化。供试品溶液中门冬氨酸峰后有一倒峰，调整流动相pH后该倒峰变为正峰，与门冬氨酸峰相连，但不影响其他杂质分离。最初一溶剂峰（保留时间约为5.2 min）与马来酸峰较难分离，通过一系列试验比较发现，该溶剂峰与流动相中的乙腈有关，使用水分含量较低或者质谱级别的乙腈可以减少溶剂峰数量，且可使溶剂峰与马来酸峰达到完全分离。

3.4 测定方法比较

2015年版《中国药典》（二部）门冬氨酸鸟氨酸原料药标准中有关物质项下同时测定了马来酸、富马酸、精氨酸、3-氨基-2-哌啶酮和β-门冬氨酰门冬氨酸的含量[8]。采用该色谱方法测定样品时，溶剂峰与马来酸峰存在重叠的现象，通过调整流动相比例、pH及更换色谱柱等均无法分开，以致无法测定样品中马来酸的含量。为此，本研究在参考上述色谱方法的基础上，改用两根氨基柱Phenomenex Luna NH2（150 mm×4.6 mm，3 μm）串联后进行试验，发现溶剂峰与马来酸峰分离效果良好，分离度符合要求。

采用本研究方法与2015年版《中国药典》（二部）方法测定精氨酸的含量时发现，其在两种色谱条件下的响应值均较低，定量限与检出限分别为8、4 ng；6批样品中精氨酸均未检出。有文献报道，采用柱前衍生化RP-HPLC法，以9-芴甲氧羰酰氯（FMOC-Cl）为柱前衍生化试剂，对鸟氨酸盐酸盐中潜在的12种氨基酸类杂质的衍生物进行测定，所建立的方法灵敏度、准确度高[13]。本研究亦尝试采用柱前衍生化RP-HPLC法，以6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯（AQC）为柱前衍生化试剂，对门冬氨酸鸟氨酸原料药进行衍生化处理后测定其中各杂质含量，方法学验证结果显示，精氨酸检测质量浓度线性范围为1.032～20.658 ?g/mL（r=0.999 9）；定量限与检出限分别为0.5、0.3 ng；精密度、稳定性、重复性试验的RSD均小于2%；加样回收率为95.33%～98.17%（RSD=1.9%，n=9）。生产企业1的3批样品中精氨酸含量分别为0.000 5%、0.001 0%、0.000 8%，生产企业2的3批样品中精氨酸均未检出。3-氨基-2-哌啶酮、富马酸和β-门冬氨酰门冬氨酸的含量与2015年版《中国药典》（二部）方法测定结果相近。

3.5 样品中有关物质测定结果比较

2家生产企业的样品质量存在一定差异，生产企业1的各杂质含量均比生产企业2高，特别是未知杂质的含量，已高于2015年版《中国药典》（二部）门冬氨酸鸟氨酸原料药中未知杂质的限度标准（0.1%）[8]。其原因可能与企业的生产工艺有关，故建议有关企业改进其工艺。

综上所述，本方法操作简便，精密度、稳定性、重复性均较好，可用于门冬氨酸鸟氨酸原料药中有关物质的测定。

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（收稿日期：2018-02-28 修回日期：2018-06-19）

（编辑：陈 宏）