姚林建 易龙 李双花 陈毅群

摘要：【目的】研究不同温度组合热处理对柑橘黄龙病的控制效果，为柑橘黄龙病防治提供新思路。【方法】以12株感染柑橘黄龙病的纽荷尔脐橙为材料，设4个处理（处理1：对照，不作任何处理；处理2：套膜，薄膜中间不打孔；处理3：薄膜中间打10个半径为1.5 cm的孔洞；处理4：薄膜中间打10个半径为3.0 cm的孔洞），每处理4株病树，分别于2017年8月6、12、19、25日和9月2日进行5次热处理试验，热处理时间为温度较高的14：00～15：00，每隔5 min记录一次温度。处理前每组采集样品作为参照组，5次热处理后再次采集样品，并通过实时荧光定量PCR（qPCR）定量分析5次热处理后病菌含量相对其参照组的倍数，分析柑橘黄龙病菌在经过热处理后的变化趋势。【结果】处理2和处理3的平均温度均超过38.0 ℃，最高温度分别为49.3和42.3 ℃；5次热处理后病树体内病菌含量显著下降（P<0.05，下同）；病情指数明显降低，病情明显好转；价值果产量下降较缓，平均损失率分别为17.71%和14.52%；但处理2的温度过高，在治疗的同时易对树体造成伤害，树冠部分出现萎蔫、焦黄等现象。处理4的最高温度仅为37.3 ℃，未达到治疗柑橘黄龙病的有效温度，其病情指数上升，病情加重，病菌含量也有所上升，价值果平均损失率为41.18%。对照组病情持续加重，树势明显衰退，病菌含量显著升高；价值果产量下降最明显，平均损失率为72.22%。【结论】经过5次热处理后，处理3的柑橘黄龙病树病情指数显著降低，症状明显减轻，树体病菌含量明显下降，树势明显好转，对柑橘黄龙病的治疗效果最佳。在发病严重的柑橘园可通过该方式延长果树的挂果周期，从而减少经济损失。

关键词： 柑橘黄龙病；热处理；实时荧光定量PCR

中图分类号： S436.661.1 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）07-1346-05

0 引言

【研究意义】柑橘黄龙病（Huanglongbing，HLB）属细菌性病害，其病原为韧皮部杆菌属中难培养细菌（Wang et al.， 2017； Hu et al.， 2018）。柑橘感染黄龙病后其树体严重衰弱，从而降低了果实产量和质量，给柑橘产业造成巨大经济损失（Qureshi and Stansly，2009）。柑橘生产大国，如中国、巴西、印度、墨西哥和美国等均受到黄龙病的严重威胁（Food and Agriculture Organization Corporate Statistical Database，2009），各柑橘生产大国均十分重视对该病的防控，投入了大量的人力、财力进行研究。至今我国仅见柑橘黄龙病菌亚洲种的报道（Candidatus Liberbacter asiaticus）（Kong et al.，2000），该病原菌能侵染目前所有已知的橘类品种（Zhang et al.，2014）。感病柑橘树田间主要表现为树势衰退，出现斑驳黄化型叶片，果实无味，出现“红鼻果”等症状（罗志达等，2009）。目前，针对柑橘黄龙病的防控仍以防为主，尚无特效药及抗病品种（Bove，2006）。因此，寻找适合大田防治柑橘黄龙病的方法，对保障我国柑橘产业的健康发展具有重要意义。【前人研究进展】热处理也称热疗，是应用较早的一种脱毒技术（Desvignes et al.，1999）。柑橘黄龙病热处理技术的主要原理是利用外界的传热介质，如光照、湿热空气、热水或蒸汽等，向感染黄龙病的柑橘植株传递足够热量，在不影响其正常生长的前提下，使黄龙病病菌钝化甚至死亡，黄龙病症状消失（Doud et al.，2014；Jumaill and Ehsani，2015）。Hoffman等（2013）在40.0～42.0 ℃的高温下对感病的柑橘苗进行热處理试验，经实时定量PCR检测，处理组柑橘黄龙病病菌含量显著降低，甚至完全消失，而对照组仍保持高度的感病状态。范国成等（2016）在夏秋季对40株感染柑橘黄龙病的柑橘树进行3次间歇性自然热罩处理，3个月后病树症状明显减轻，病菌含量也显著降低，平均降低80.00%以上，最高下降了99.98%，而对照组病菌含量则显著增加，平均增加了20倍。【本研究切入点】目前，利用热处理方式对黄龙病树进行治疗已有少量研究报道，但仍未得出最佳的温度与时间组合治疗方法。【拟解决的关键问题】根据高温可降低或消灭柑橘植株体内黄龙病病菌的原理，利用夏秋季节的高温，在感染柑橘黄龙病的果园选择适合的病树进行热处理试验，通过实时荧光定量PCR（qPCR）定量分析不同组合热处理对柑橘黄龙病的治疗效果，从而寻找合适的温度与时间搭配方式，为柑橘黄龙病防治提供新思路。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

试验于2017年在江西省赣州市崇义县关刀坪3～6年生纽荷尔脐橙园内进行。选取16株地理位置相近的脐橙树，每株在标记枝条上采集4张叶片，经常规PCR和实时荧光定量PCR检测均感染黄龙病。

1. 2 试验方法

试验设4个处理，每处理4株病树，处理1为对照（CK），其他3组用薄膜进行相应处理，其中处理2薄膜中间不打孔、处理3薄膜中间打10个半径为1.5 cm的孔洞、处理4薄膜中间打10个半径为3.0 cm的孔洞，以控制膜内温度。将聚乙烯薄膜套在试验病树上方自制的支架上，地面用泥土封实，对照组不作任何处理。选择热处理的时间为温度较高的14：00～15：00。每组悬挂1个温度计，每隔5 min记录一次数据。每处理重复3次。试验区除特别注意柑橘木虱的防治外其他按常规管理，处理组和对照组保持水肥、施药一致。从2017年8月6日开始进行热处理，此后的处理时间分别为8月12、19、25日和9月2日（所选时间当天最高温度均超过30.0 ℃）。在第1次热处理前及最后一次热处理后各采集样品一次，热处理前样品作为参照组。采样方法：在病树树冠的前后左右中5个方位随机采样，各方位采集4片成熟叶片，为保证叶片病菌的含量不变，采集的叶片要尽快处理或置于4 ℃保存。

1. 3 柑橘黄龙病病症评估方法

为更直观地了解热处理对病树的影响，参考范国成等（2016）的评估方法，根据叶片病害严重程度共分为4个等级：0级，叶片上无斑驳黄化症状，树势良好；1级，叶片斑驳黄化面积少于1/3，树势一般；2级，叶片斑驳黄化面积在1/3～2/3，树势较差；3级，叶片斑驳黄化面积大于2/3，树势极差。在试验组和对照组病树上选取病症直观，存在较大级别差异的病枝，记录并标记20片叶片的病症级别，在所有热处理结束后再观察一次，计算病情指数。

病情指数=∑（各级病叶数×相对级数值）/（调查总叶数×3）×100

1. 4 DNA提取及qPCR检测分析

切取各叶片少许中脉，在液氮中研磨成粉末，用CTAB法提取DNA，用微量核酸浓度仪（NanoDrop One/OneC）测定各样品的DNA浓度，并将其浓度稀释至50 mg/L，置于超低温冰箱中保存。

qPCR检测引物和内参引物分别为HLB-CQULas04F/HLB-CQULas04R（陈仕钦，2013）和UPL7-F/UPL7-R（卢占军等，2016），引物均由华大基因公司合成。qPCR反应体系20.0 μL，其中上、下游引物各0.5 μL，无菌水8.0 μL，稀释的DNA模板1.0 μL，SYBR Master Mix 10.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，采集荧光信号，进行40个循环；熔解曲线，95 ℃ 10 s，67 ℃ 5 s，每增加0.5 ℃ 5 s， 95 ℃ 15 s。每个样品3个重复，每次扩增分别设1个阳性对照、1个阴性对照和1个清水对照。反应在ABI Step-One上运行。

以qPCR检测分析得到的循环阈值（Cycle thresho-ld，Ct）分别为目的基因和内参基因的Ct。根据所得的Ct计算每次样品相对参照组的倍数，从而得出柑橘黄龙病菌在经过热处理后的变化趋势。qPCR检测的Ct为3次检测结果的平均值，参考Livak和Schmittgen（2001）的方法进行计算。

1. 5 统计分析

采用SPSS 12.0对试验数据进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2. 1 各处理温度检测结果

由表1可知，对照组在5次热处理中的最高和最低温度分别为33.2和30.2 ℃；处理组平均温度均高于对照组，其中以处理2的平均温度最高，其最高和最低温日与对照组的温差分别为17.2和14.4 ℃；处理4的平均温度相对较低，其最高和最低温日与对照组的温差分别5.8和4.6 ℃；处理3的平均温度均在38.0 ℃以上，其最高平均温度为42.3 ℃。差异显著性分析结果表明，只有处理2与对照组存在显著差异（P<0.05，下同），处理3和处理4与对照组差异不显著（P>0.05，下同）。可见，覆膜处理可有效提高树体周围温度，通风口面积是影响膜内温度的重要因素。

2. 2 柑橘黄龙病病症评估结果

由表2可知，带病树经过5次热处理后，处理3的症状有明显好转，病情指数明显降低，较处理前降低27.73%，抽生了大量新梢，且叶片无明显斑驳黄化症状，树势较处理前有明显好转；处理2的病情虽有明显好转，但因温度过高对树体造成伤害，树冠部分出现萎蔫、焦黄等现象；对照组和处理4的斑驳黄化症状明显加重，病情指数均高于处理前，部分叶片全部黄化出现木栓化。可见，温度是进行田间热处理的关键因素，处理4的最高温度仅为37.3 ℃，未达到杀灭或抑制病菌的温度，从而使病情加重，但相较于对照组其病情加重的速度较慢；而处理2和处理3的平均温度均在38.0 ℃以上，热处理效果显著。

2. 3 柑橘黄龙病病菌含量变化分析结果

qPCR检测结果（表3）表明，5次热处理后，处理2和处理3的病菌含量相对其参照组有明显降低，分别是其参照组的28.00%和30.67%倍，表明試验树的病情有明显好转；对照组经过5次热处理后病菌含量快速增加，是其参照组的6.5631倍；处理4的病菌含量相对其参照组有所上升，是其参照组的1.6301倍，但较对照组上升速度减缓。可见，未经热处理的感病柑橘树在自然条件下病菌浓度上升极快，而经过5次超过38.0 ℃的热处理治疗后病菌含量均有所下降，但平均温度达49.3 ℃后会对树体造成伤害。

2. 4 柑橘黄龙病树价值果产量分析结果

如图1所示，经过5次热处理后，柑橘黄龙病病树的价值果（具有经济价值的商品果）总体产量均有所下降，其中，对照组价值果产量下降最明显，价值果平均损失率为72.22%；处理4的热处理温度虽然较低，但对病情起到一定的延缓作用，价值果产量下降相对较慢，价值果平均损失率为41.18%；处理2和处理3的价值果产量下降较缓，价值果平均损失率分别为17.71%和14.52%。可见，有效的热处理使病树的病情得以减轻，同时对病菌的复制起到抑制作用，有效地降低了价值果的损失率。

3 讨论

目前报道我国柑橘黄龙病病原为耐热型的亚洲种，其在35.0 ℃以下能正常增殖，但经过38.0 ℃以上高温处理后病菌浓度会明显下降（Lopes et al.，2009）。在田间热处理过程中，温度过高会导致植株芽条焦死。研究表明，植株芽条致死温度与黄龙病病菌杀灭温度存在明显差异（贾志成等，2015），因此，正确选取田间热处理的温度和时间，在有效热处理杀灭病菌的同时不破坏树体尤为关键。

本研究利用8～9月的夏秋高温、强光照，用聚乙烯膜对感病柑橘树进行热处理，处理2和处理3的平均温度在38.0 ℃以上，均达到破坏黄龙病病菌亚洲种的有效温度，在经过5次热处理后，病树的病情指数较处理前有明显降低，而对照组和处理4的病情指数明显升高。处理3的树势有明显好转，新抽的枝条无斑驳黄化型叶片出现，处理后斑驳黄化叶片症状也相应减轻。处理2整体树势有所好转，病症也相应减轻，但由于热处理的温度过高，最高温度达49.3 ℃，超过其正常生长温度，对树体造成伤害。对照组和处理4的平均温度均在38.0 ℃以下，最高温度分别为33.2 ℃和37.3 ℃，未达到破坏柑橘黄龙病病菌的有效温度，病情加重，出现更明显的斑驳黄化型叶片，树势逐渐变差，新梢抽生较少。

5次熱处理的结果表明，有效的热处理后柑橘黄龙病病菌浓度明显下降，处理2和处理3植株病菌含量较其参照组分别降低至26.00%和30.67%倍；对照组和处理4病菌含量明显升高，病菌含量分别是其参照组的6.5631和1.6301倍。说明高温有抑制病原菌增殖的作用，使树体内病原菌含量降低。

本研究结果显示，在5次热处理后感病柑橘树虽然病情有所好转，但仍可检测出黄龙病菌，其原因可能是5次的热处理不足以消除树体内的全部病菌，也可能是黄龙病菌在高温时失去活性，在常温下又得以恢复；此外，热处理方法无法对病树根部进行处理，根部的病菌难以清除。鉴于热处理方法无法根除病树体内的病菌，结合其他措施防治又会加大成本，因此，对于发病较轻的果园不宜使用该法处理感病柑橘树，可及早挖除补种无病苗木，对于发病严重且周边无其他柑橘园的病树可采用热处理方法以延长果树挂果年限。

4 结论

田间感染柑橘黄龙病的病树经过5次热处理后，薄膜中间打10个半径为1.5 cm孔洞的处理能达到治疗柑橘黄龙病的有效温度，其病情指数显著降低，症状明显减轻，树体病菌含量明显下降，树势明显好转，对柑橘黄龙病的治疗效果最佳。在发病严重的柑橘园可通过该方式以延长果树的挂果周期，从而减少经济损失。

参考文献：

罗志达，叶自行，许建楷，胡桂兵. 2009. 柑桔黄龙病的田间诊断方法[J]. 广东农业科学，（3）：91-93. [Luo Z D， Ye Z X， Xu J K，Hu G B. 2009. Field diagnosis method of Citrus Huanglong[J]. Guangdong Agricultural Sciences，（3）： 91-93.]

范国成，林雄杰， 王贤达，胡菡青，Xia Yulu. 2016. 田间自然热罩治疗柑橘黄龙病的效果分析[J]. 果树学报，33（9）：1139-1147. [Fang G C， Lin X J， Wang X D，Hu H Q，Xia Y. 2016. A field study of the efficacy of PVC film cover in controlling Huanglongbing[J]. Journal of Fruit Science，33（9）：1139-1147.]

陈仕钦. 2013. 柑橘黄龙病防控药剂筛选及防控技术研究[D]. 重庆：重庆大学. [Chen S Q. 2013. Study on chemical compounds screening and control technologies against the Citrus Huanglong in plantation field[D]. Chongqing：Chongqing University.

卢占军， 赵培娅， 刘映雪，丁鹏，苏华楠，易龙，钟八莲. 2016. 亚洲韧皮杆菌在单株脐橙病树的分布情况[J]. 南方农业学报，47（9）：1512-1516. [Lu Z J， Zhao P Y， Liu Y X，Ding P， Su H N， Yi L， Zhong B L. 2016. Distribution of Candidatus Liberibacter asiaticus in individual navel orange tree[J]. Journal of Southern Agriculture，47（9）： 1512-1516.]

贾志成， 郑加强， 黄雅杰， 周宏平， Ehsani Reza. 2015. 柑橘黄龙病热处理防治技术研究进展[J]. 农业工程学报， 31（23）：1-9. [Jia Z C， Zheng J Q， Huang Y J， Zhou H P， Reza E. 2015. Research progress on control techniques for heat treatment of Citrus Huanglongbing[J].Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering， 31（23）：1-9.]

Bove J M. 2006. Huanglongbing： A destructive， newly-emerging， century-old disease of citrus[J]. Journal of Plant Pathology， 88（1）： 7-37.

Desvignes J C， Boyé R， Cornaggia D， Grasseau N. 1999. Virus diseases of fruit trees[Z]. Paris：Centre Technique Interprofessionnel des Fruits et Légumes.

Doud M， Zhang M Q， Powell C A，Duan Y P. 2014. Thermotherapy and chemotherapy to control Citurs HLB in the field[J]. Journal of Citrus Pathology， 1（1）： 213.

Food and Agriculture Organization Corporate Statistical Database（FAOSTAT）. 2009. Food and agricultural commodities production： Countries by commodity： Oranges[EB/OL]. http：//faostat.fao.org/SITE/339/default.aspx.

Hoffman M T， Doud M S， Williams L，Zhang M Q，Ding F，Stover E，Hall David，Zhang S，Jones sL，Gooch M，Fleites L， Dixon W，Gabriel D，Duan Y P. 2013. Heat treatment eliminates ‘Candidatus Liberibacter asiaticus from infected citrus trees under controlled conditions[J]. Phytopathology，103（1）：15-22.

Hu J，Jiang J，Wang N. 2018. Control of citrus huanglongbing via trunk injection of plant defense activators and antibio-tics[J]. Phytopathology， 108（2）：186-195.

Jumaill A， Ehsani R. 2015. Mobile batch heat treatment system for treating HLB-infected citurs trees[C]. ASABE Annual International Meeting， paper No.15219319.

Kong W W，Deng X L，Liang Z H，Tang W W. 2000. Cloning and sequencing of the Citurs Huanglongbing pathogen DNA[J]. Acta Phytopathologica Sinica，30：71-75.

Livak K L， Schmittgen T D. 2001. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method[J]. Methods，25（4）：402-408.

Lopes S A，Frare G F，Bertolini E，Cambra M，Fernandes N G，Ayres A J，Marin D R，Bove J M. 2009. Liberibacters associated with Citurs Huanglongbing in Brazil： ‘Candidatus Liberibacter asiaticus is heat tolerant， ‘Ca. L. ameri-canus is heat sensitive[J]. Plant Disease， 93（3）：257-262.

Wang N，Stelinski L L，Pelz-Stelinski K，Graham J H，Zhang Y. 2017. Tale of the huanglongbing disease pyramid in the context of the citrus phytobiome[J]. Phytopathology， 107（4）：380-387.

Qureshi J A， Stansly P A. 2009. Exclusion techniques reveal significant biotic mortality suffered by Asian citrus psyllid Diaphorina citri（Hemiptera： Psyllidae） populations in Florida citrus[J]. Biological Control， 50（2）：129-136.

Zhang M Q， Guo Y， Powell C A，Doud M S，Yang C，Duan Y P. 2014. Effective antibiotics against ‘Candidatus Liberibacter afrianus in HLB-affected citrus plants identified via the graft-based evaluation[J]. PLoS One， 9（11）：e111032.

（責任编辑 麻小燕）