童爱均 赵超 曾峰

摘 要：β葡萄糖苷酶是纤维素分解酶系中的重要组成部分，具有广泛的应用前景。以牛瘤胃为材料，筛选得到4株β葡萄糖苷酶产生菌株，采用3，5二硝基水杨酸（DNS）法测定各菌株的β葡萄糖苷酶酶活力，选取1株β葡萄糖苷酶酶活力较高的菌株，结合16S rDNA序列分析方法对其进行分子生物学鉴定。结果表明：筛选到1株产β葡萄糖苷酶活力为6.589U·mL-1的菌株命名为TA1；经鉴定该菌株为液化沙雷菌属（Serratia liquefaciens）。研究结果对产β葡萄糖苷酶的微生物资源获取具有一定的借鉴意义。

关键词：β葡萄糖苷酶；16S rDNA序列；分子生物学鉴定

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2018.07.002

Abstract： βglucosidase is an important component of the cellulolytic enzyme system and has broad application prospects. Four βglucosidaseproducing strains were screened from bovine rumen， and the enzymatic activity of βglucosidase was determined by 3，5dinitrosalicylic acid （DNS） method， seletcted a strain which had high βglucosidase activity，and the molecular biology of strain was identified by 16SrDNA sequence analysis. The results showed that an obtained strain with enzyme activity of6.589U·mL-1was named TA1. This strain which was identified to be Serratia liquefaciens. The research results have certain reference significance for the acquisition of microbial resources for producing βglucosidase.

Key words： βglucosidase； 16S rDNA sequence； identification by molecular biology

β葡萄糖苷酶是一种能催化水解芳基或烃基与糖基原子团之间的糖苷酶键生成葡萄糖的纤维素水解酶類[1]。β葡萄糖苷酶广泛存在于植物、动物、微生物等各种生物体内[2-5]。β葡萄糖苷酶是降解纤维素的主要组分之一，在纤维素降解中起着非常重要的作用[6-9]。因此，筛选高产β葡萄糖苷酶的微生物对纤维素有效降解具有重要意义。β葡萄糖苷酶被广泛应用于食品、饲料、加工工业和医疗等领域[10-12]。在食品工业中，β葡萄糖苷酶主要用于改良果汁风味[13]。但目前β葡萄糖苷酶活力偏低，本研究以获取高产β葡萄糖苷酶的菌株为目的，从牛瘤胃中筛选得到1株β葡萄糖苷酶的产生菌株，为产β葡萄糖苷酶的微生物资源获取提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

1.1.1 菌体和菌种 菌体：牛瘤胃的提取液；工程菌：本实验室保存的E.coli DH5α。

1.1.2 主要试剂 K2HPO4·3H2O、KH2PO4、MgCl2·6H2O、NH4Cl、NaCl、FeSO4、琼脂、葡萄糖为国产分析纯或化学纯，DNA分子标准品和PCR有关试剂为上海生工生物工程有限公司生产。

1.1.3 主要仪器 超净工作台（SWOJFD），苏州净化设备有限公司；电热鼓风干燥箱（DHG9240A），上海恒一科学仪器有限公司；隔水式恒温培养箱（GSP9160M），上海博讯实业有限公司；全温振荡器（ZHWY211B），上海智城分析仪器设备有限公司；高压灭菌锅（G180TW），美国致微（厦门）仪器有限公司；超纯水系统（明澈TMD），Merck millipore有限公司；低速离心机（SC3612），上海双旭电子有限公司；高速冷冻离心机（Avanti），Beckman 公司；PCR仪（PC814A），日本ASTEC公司；电泳仪（PROTBANIIXI2D），BIORAD 公司；凝胶成像系统（FIREREADER V4），UVITEC公司；电子天平（ME204E），梅特勒托利多仪器（上海）有限公司。

1.2 培养基

初筛培养基：K2HPO4·3H2O 1.96 g·L-1，KH2PO4 0.75 g·L-1，MgCl2·6H2O 0.4g·L-1，NH4Cl 0.9 g·L-1，NaCl 0.9 g·L-1，1%FeSO4 0.3 mL ，羧甲基纤维素钠（简称CMC）1%，pH值为6.0，1.6%琼脂，高压灭菌（121℃，20 min），倒平板备用。

发酵培养基：K2HPO4·3H2O 1.96 g·L-1， KH2PO4 0.75 g·L-1， MgCl2·6H2O 0.4 g·L-1， NH4Cl 0.9 g·L-1， NaCl 0.9 g·L-1，1%FeSO4 0.3 mL， CMC 1%，pH值为6.0，高压灭菌（121℃，20 min），备用。

1.3 试验方法

童爱均等：产β葡萄糖苷酶菌株的筛选与鉴定2018年第7期

2018年第7期童爱均等：产β葡萄糖苷酶菌株的筛选与鉴定

1.3.1 菌株的初筛 取牛瘤胃1 mL于50 mL液体培养基放在37℃空气恒温摇床培养3 d后，培养后的菌液稀释成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6悬浊液，取稀释后的菌液1 mL于初筛培养基中进行培养，温度为37℃，时间为3 d。将培养后的平板挑取单菌落再次划线纯化，直到获得纯菌落为止。将分离得到的纯菌株点到初筛培养基上培养3 d后用1

mg·mL-1的甘果红溶液染色20 min，倒掉染色液后用1mol·L-1NaCl 溶液脱色30 min。以透明圈直径和菌落直径的比值大小作为筛选菌株的标准，再将筛选到的菌株进行复筛。

1.3.2 菌株的复筛 将初筛得到的菌株按5%的接种量接种到液体发酵培养基中于37℃、120r·min-1，振荡培养3 d。取发酵液，于4℃、8000r·min-1离心20 min去菌体，取其上清液用DNS法测定β葡萄糖苷酶活力，挑选酶活力最高且稳定的菌株。

1.3.3 葡萄糖标准曲线的制作 准确称取100 mg分析纯葡萄糖，用少量蒸馏水溶解后，定容至100 mL，浓度为1mg·mL-1。各试剂用量列于表1。

将各管溶液混匀后，在沸水浴中加热10 min，然后取出，立即用流动水冷却至室温，分别用蒸馏水定容至10 mL并摇匀。于540 nm处测吸光值。以葡萄糖含量（mg）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.4 DNS法测定酶活力 吸取粗酶液0.5 mL，加入经30℃保温10 min、含1%CMC、pH值为7.0的磷酸盐缓冲液1.5 mL，30℃保温30 min。然后加入3 mLDNS液，放入沸水浴中煮沸10 min后，迅速用流动水冷却至室温，再用蒸馏水定容至10 mL（DNS为钝化酶活做空白对照）。1 h内用可见分光光度计在540 nm处比色测定。测量得到的数据代入由标准曲线测量值计算出来的回归方程，在由回归方程计算出相应的被测酶液所含葡萄糖量，根据酶活力计算公式算出酶活力大小。酶活力定义为上述条件下，1 mL发酵液1 min催化底物生成1 umol還原糖（以葡萄糖量计）为1个酶活力单位U，酶活力计算公式：U=（B×n/T×V）×v×1000/180

式中U：葡萄糖酶活力（U·mL-1），B：从标准曲线得到的净葡萄糖含量，n：酶液稀释倍数，v：酶和底物反应体积（mL），1000mg·ug-1，T：酶和底物反应时间（min），V：测定时稀释酶液体积（mL），180：葡萄糖分子量。

1.3.5 菌株分子生物学鉴定

1.3.5.1 总DNA提取 随机选取筛选出的单菌株，在发酵培养基上培养48 h，然后用CTAB/NaCl少量提取法提取。

1.3.5.2 目的基因片段PCR扩增 利用通用扩增16SrRNA基因的引物27F：5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′和1492R：5′TACGGCTACCTTGTTACGACTT3′，以基因组DNA为模板，进行PCR反应。设计PCR的体系为25 μL，其中ddH2O 15.5 μL，5×PCR缓冲液 5.0 μL，dNTP2.0 μL，引物0.5 μL，DNA模板1.0 μL，Taq酶 0.5 μL。其中PCR扩增参数为：首先95℃预变性3 min，94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1.5 min，35个循环，最后在72℃延伸10 min，12℃终止反应。通过琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果。

1.3.5.3 重组质粒的构建和鉴定 PCR产物用胶回收试剂盒回收，连接PMD18T载体后，转化大肠杆菌E.coliTop10，菌落PCR检测阳性克隆子。

1.3.5.4 阳性克隆的验证 质粒的提取：从16SrDNA文库中随机挑取30个克隆子分别接种于含有20mg·mL-1Amp+的5 mL LB培养液中，与200 r·min-1摇床37℃下培养12 h，采用上海生工Sanprep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒，提取步骤参见试剂盒说明书。通过琼脂糖凝胶电泳观察质粒提取结果。

重组质粒酶切验证：按质粒DNA 8 uL，EcoRⅠ 1 uL，Hind Ⅲ1 uL ，Buffer（10×）2 uL，ddH2O 8 uL体系于37℃水浴反应3～5 h。水浴后通过琼脂糖凝胶电泳观察酶切验证的结果。酶切成功后送生工生物工程（上海）有限公司测序。

2 结果与分析

2.1 菌种平板的初筛

将分离得到的纯菌株点到初筛培养基上培养3 d后用1 mg·mL-1的甘果红溶液染色20 min，倒掉染色液后用1 mol·L-1 NaCl 溶液脱色30 min。以透明圈直径和菌落直径的比值大小作为筛菌的标准。试验结果表明，有4株菌株能够产生水解圈。将得到的4株菌株能够产生水解圈单菌落进行复筛。图1为某个菌株初筛在平板上得到的水解透明圈。

2.2 复筛结果

2.2.1 葡萄糖标准曲线的制作 从葡萄糖标准曲线图（图2）可见，葡萄糖含量与其吸光值呈良好的线性函数关系，其函数关系式为y=0.4982x-0.0171，式中的y表示OD值，x表示葡萄糖含量，R2=0.997，表明线性关系良好，可以用作标准曲线。

2.2.2 酶活力复筛 将初筛得到的菌株用DNS法测β葡萄糖苷酶活力，挑选酶活力最高且稳定的菌株。用DNS法测定β葡萄糖苷酶活力得到的结果如图3所示。由图3可以看出，1号菌株的酶活力最高，为6.589 U·mL-1。通过复筛获得的1号菌株其产β葡萄糖苷酶酶活力较高，并对其进行反复培养，证明其产酶特性较为稳定。因此，将该菌株命名为TA1，并对其进行分子生物学鉴定。

2.3 菌株鉴定

2.3.1 16SrDNA PCR扩增及克隆结果 利用通用扩增16SrRNA基因的引物27F对菌株TA1进行PCR扩增并通过琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果，TA1 16SrDNA PCR扩增结果如图4所示。PCR产物用胶回收试剂盒回收，连接PMD18T载体后，转化大肠杆菌E.coliTop10，菌落PCR检测阳性克隆子。从16SrDNA文库中随机挑取30个克隆子，通过琼脂糖凝胶电泳观察质粒提取结果。再通过重组质粒酶切验证表明获得的扩增产物酶切成功。

2.3.2 菌株16SrDNA序列测定 将酶切成功后的扩增产物送至上海生工生物公司进行序列测定。菌株TA1的16SrDNA序列长度为1597 bp，将测序得到的序列后期用NCBI数据库进行比对。其具体序列信息为见图5。

2.3.3 同源性分析以及系统发育树 将测序得到的序列用NCBI数据库进行比对，下载与目标菌株序列同源性较高的菌株14株，运用MEGA5.0软件以NJ计算方法生成系统发育进化树，结果如图6所示。其同源性高达99%，表明鉴定的菌株为液化沙雷菌属（Serratia liquefaciens） 。

3 结论

通过刚果红染色鉴定产β葡萄糖苷酶菌是一种快速简便的筛选方法，透明圈直径和菌落直径大小的比值能够直接反应菌落产β葡萄糖苷酶的能力。本研究以牛瘤胃为材料，通过初筛得到4株β葡萄糖苷酶产生菌株，采用3，5二硝基水杨酸（DNS）法测定β葡萄糖苷酶酶活力，得到1株酶活力为6.589 U·mL-1的菌株命名为TA1。经16SrDNA分子生物学鉴定，该菌株为液化沙雷菌属（Serratia liquefaciens）。研究结果对产β葡萄糖苷酶的微生物资源获取具有一定的借鉴意义。

参考文献：

[1]LUO G， XIE L， ZHOU Q，et al.Enhancement of bioenergyproduction from organic wastes by twostage anaerobichydrogen and methane production process[J].Bioresource Technology，2011，102（18）：8700-8706.

[2]杨浣漪，崔美林，金成日，等.灰树花发酵产β葡萄糖苷酶和胞内多糖培养基及条件优化[J].中国食品学报，2017，17（5）：90-98.

[3]苏龙，梁广波，龙文英，等.产β葡萄糖苷酶罗尔夫青霉发酵条件的优化[J].贵州农业科学，2017，45（2）：105-111.

[4]魏胜华，钱伟，周清华，等.β葡萄糖苷酶纳米凝胶非水相合成红景天苷[J].化工进展，2018，37（2）：694-701.

[5]姚瑶，刘庆，刘福，等.β葡萄糖苷酶的性质及其在食品加工中的应用研究进展[J].贵州农业科学，2018，46（2）：132-135.

[6]黄玉兰，李征，刘晓宁，等.一株耐低温纤维素酶高产菌株的筛选、鉴定和产酶的初步试验[J].微生物学通报，2010，37（5）：637-644.

[7]ZHANG Y H P，Himmel M E，Mielenz J R.Outlook for cellulase improvement：Screening and selectionstrategies[J].Biotechnology Advances，2006，24（5）：452.

[8]JUTURU V，WU J C.Microbial cellulases：Engineering，production and applications[J].Renewable and Sustainable Energy Reviews，2014，33：188-203.

[9]KYU K L，PASON P，MORI Y，et al.Isolation and characterization of endocellulasefree multienzymecomplex from newly isolated thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum strain NOI1[J].Journal of Microbiology and Biotechnology，2011，21（3）：284-292.

[10]彭邦遠，罗昱，张洪礼，等.β葡萄糖苷酶对刺梨汁香气物质的影响[J].中国酿造，2017，36（7）：172-177.

[11]庞凤梅，李玉浸，杨殿林，等.农作物秸秆沼气发酵与直接利用效益比较[J].中国沼气，2008，26（2）：34-37.

[12]刘思颖，樊婷婷，陈雄.稻草秸秆干发酵产沼气工艺条件的优化[J].化学与生物工程，2010，27（12）：83-85.

[13]王霏，王绍琛，曹明明，等.土壤微生物中新型β葡萄糖苷酶的挖掘与鉴定[J].微生物学通报，2018，45（1）：71-80.

（责任编辑：林玲娜）