非O157型产志贺毒素大肠杆菌分子进化和流行特征分析

2018-09-05马崇礼杨俊段合波毕旺来

生物化工 2018年4期

马崇礼，杨俊，段合波，毕旺来

（武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北武汉 430023）

产志贺毒素大肠杆菌（Shinga Toxin-producing Escherichia coli，STEC）是一大类能产生志贺毒素的大肠埃希菌总称，是重要的食源性致病菌[1]。感染严重者可引起出血性结肠炎（HC）、溶血性尿毒综合征（HUS）和血栓性血小板减少性紫癜（TTP）等并发症，HUS和TTP的病死率较高[2]。产志贺毒素大肠杆菌具有多种血清分型，根据其O抗原可以分为174种，根据其H抗原可分为53种[3]。从血清学分类来看，大肠杆菌O157:H7是产志贺毒素大肠杆菌中致病力最强、流行趋势最广、发病率最高的流行株，一直受到公共卫生和食品安全领域的重点关注。但近年来，世界各地报道了由非O157型产志贺毒素大肠杆菌引起的多起疫情，最著名的事件就是2011年德国大肠杆菌O104:H4暴发疫情，一共造成约4400人感染，死亡50例，850人发展为HUS，需长期治疗[4]。

非O157型产志贺毒素大肠杆菌引发的公共卫生事件逐渐突显[5]，2012年因美国感染产志贺毒素大肠杆菌而发病的231157个病例中，59.7%为非O157：H7血清型感染，40.3%为O157:H7感染[6]。目前发现，有超过200种非O157血清型的产志贺毒素大肠杆菌能引起人类疾病[7]。美国1983—2002年期间，O26、O45、O103、O111、O121和 O145血清型感染导致的人群发病率占非O157型产志贺毒素大肠杆菌致病总人数的75%，这6种血清群也被称为“Top Six”[7]。范如岳等人鉴定了中国不同来源的434株非O157产志贺毒素大肠杆菌分离株，除不可分型菌株外，共检测出82种O血清群和28种H型，其中O20:H30、O2:H32和O2:H45为优势血清型[8]。由此可见，我国非O157产志贺毒素大肠杆菌主要流行株与其他国家可能存在不同之处。

产志贺毒素大肠杆菌分布广泛，可以畜禽肉、蔬菜、水果等为载体传播，因此对人类健康的危害极大[9]。产志贺毒素大肠杆菌最主要的毒力因子是志贺毒素。志贺毒素（Stx）具有细胞毒性、肠毒性、神经毒性作用，是毒性最强的细菌毒素，可损害机体中枢神经系统、肠道、肾脏[10]。志贺毒素可分为志贺毒素1（Stx1）和志贺毒素2（Stx2），志贺毒素2致病力强于志贺毒素1，是导致病人得HUS的最主要原因[11]。志贺毒素1的编码基因stx1具有高度保守性，而志贺毒素2的编码基因stx2序列变化很大，可分为stx2、stx2c、stx2d、stx2e 和 stx2f等亚型[12]。

目前，国际上尚无统一的分离鉴定非O157产志贺毒素大肠杆菌的标准方法。由于非O157产志贺毒素大肠杆菌血清型众多，营养条件多样化，至今还未找到某种特定的生化特征，能有效地从食品或临床样本中分离非O157型产志贺毒素大肠杆菌。非O157血清型产志贺毒素大肠杆菌检测技术相较O157更加困难，即便病人感染了非O157型产志贺毒素大肠杆菌，临床上也较难确认[13]。由于携带志贺毒素编码基因是产志贺毒素大肠杆菌的共有特征，因此采用PCR技术来检测stx是分离和鉴别产志贺毒素大肠杆菌最有效的方法[14]。由于志贺毒素2的致病力明显强于志贺毒素1，本文主要对生物信息学数据库现有的非O157型产志贺毒素大肠杆菌志贺毒素2基因序列进行分析，以期为开发非O157型产志贺毒素大肠杆菌分子快速检测试剂盒、制定防控对策等提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 数据来源

从 NCBI GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）数据库搜索并下载截至2017年8月时公布的全部非O157型产志贺毒素大肠杆菌志贺毒素2基因（stx2）全长序列，将序列提交到EBI网站（http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/）上进行多序列比对。除DNA序列信息外，还从NCBI GenBank数据库收集了每个菌株的血清型、采集年代、采集地点、宿主类型等流行病学信息。

1.2 进化树分析

用mega 4.1软件采用邻位相连法（Neighborjoining）构建进化树。根据基本的进化树拓扑结构，采用1000次Bootstrap抽样对树进行评价分析。

2 结果与分析

从NCBIGenBank数据库共下载197条stx2基因全长序列，用于多序列比对和构建进化树。由于所用序列比较多，图1仅列出其中53条具有代表性的序列所构建的进化树。进化树的主要节点Bootstrap值均在50%以上，表明所得到的树的结构可信。基因亚型分类综合了进化树结果和NCBIGenBank数据库序列亚型信息。从图1可知，stx2基因可以分为7种基因亚型，分别为stx2a、stx2c、stx2d、stx2e、stx2g、stx2v和 stx2f。

表1列举了197株携带stx2基因的分离株的血清型和基因亚型信息。其中，stx2d共有45条序列，主要来自德国、美国、澳洲和日本，部分来自中国、丹麦、比利时、波兰和加拿大；stx2v共有42条，主要来自于美国、德国、比利时和加拿大，部分来自荷兰、中国、日本等；stx2a共有40条，主要来自美国、加拿大和挪威，部分来自法国、德国、荷兰、比利时等；stx2c共有36条，主要来自美国、中国和比利时，部分来自德国、印度、瑞士等；stx2e共有16条，绝大部分来自德国，部分来自中国和越南；stx2g共有11条，来自于德国、西班牙、日本、美国、中国等；基因亚型最少的是stx2f，共有7条，来自于美国、德国和日本。我国公布的非O157菌株基因型主要属于stx2c、stx2d、和 stx2e。

图1 进化树分析

197株产志贺毒素大肠杆菌中最主要的血清型为O121，菌株主要来源于美国、挪威、意大利、加拿大和荷兰。除O121血清型外，还有O26、O104、O111、O174、O93、O170、O8、O2、O91和O45等血清型。我国流行的血清型分布广泛，有O159、O8、O163、O49和O74等。

3 讨论

近年来，由非O157血清型大肠杆菌致病菌引起的食物中毒事件持续增长，因此检测非O157血清型的致病性大肠杆菌非常重要。志贺毒素是大肠杆菌导致人类发病的主要毒力因子，目前国际上非O157产志贺毒素大肠杆菌序列大多是由美国、欧洲提交的，而我国所提交的序列较少。目前欧美等国主要检测以O121血清型为代表的“Top Six”，而本文从NCBI GenBank数据库采集到的流行病学信息分析可知，我国非O157产志贺毒素大肠杆菌流行的血清型并非“Top Six”。因此我国需要针对性研发DNA探针杂交等新型检测方法，来取代基于菌株间表型差异的传统培养分离检测方法，进而提升检测的快速性和准确性。