涂招秀，谢欣，胡居吾＊，黄斌华

（1.江西省科学院，江西南昌 330096；2.江西华紫仁农业开发有限公司，江西赣州 330000）

蔓三七，又名平卧菊三七、蛇接骨、续命草、神仙草，味辛、微苦、性凉，为多年生草本药食两用植物。蔓三七茎叶营养丰富，富含粗多糖和绿原酸，同时还含有总黄酮、维生素A、维生素C、氨基酸和有机钙等成分。民间利用其通经活络，消肿止痛，消炎止咳，治疗跌打损伤，支气管肺炎、肺结核等[1]。现代生物化学和医学研究证明，蔓三七具有通经活络、消炎止咳、散淤消肿、活血生肌等功效[2]，能延缓衰老、激活免疫细胞、改善机体免疫功能、提高人体免疫力，增强人体的新陈代谢并对记忆障碍有一定改善作用[3]；具有降血压、降血糖和预防慢性肾病、抑制乙型肝炎的显著效果[4]；对预防和治疗心脑血管疾病、糖尿病等有一定的疗效[5]；还具有抗病毒、抗菌活性、抑制骨髓癌和志贺样毒素细胞的活性[6]。

动态超高压微射流技术是一种新兴的超微细化技术[7]，目前常被用于灭菌作用[8]、多糖的提取[9]、蛋白质改性[10]等。运用动态超高压微射流技术来提取黄酮的研究相对较少。

本实验采用正交实验优化动态超高压微射流技术提取蔓三七叶中黄酮的最佳工艺参数，以达到提高蔓三七叶中黄酮的得率为目的，为全面开发和利用蔓三七提供理论和技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蔓三七，江西华紫仁农业开发有限公司，烘干、粉碎后过20目筛备用。芦丁标准品，中药固体制剂制造技术国家工程研究中心；其余试剂，均为国产分析纯。

MFIC高压微射流均质机（M-700 Series），美国Microfluidics公司生产；高压均质机（GY50-6S），上海华东高压均质机厂生产；可见分光光度计（722G），上海驰唐实业有限公司生产；电子分析天平（AL104），梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司生产。

1.2 实验方法

1.2.1 芦丁标准曲线的绘制

精确称取在120 ℃干燥至恒重的芦丁对照品0.2000 g，置于100 mL容量瓶中，加80%乙醇70 mL，置于水浴上微热使溶解，冷却至室温，加乙醇至刻度，摇匀。精密吸取10 mL置于100 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得0.2 mg/mL芦丁对照品溶液。

精密量取对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL和7.0 mL，分别置25 mL容量瓶中，加乙醇6 mL，加入5%亚硝酸钠溶液1.0 mL，混匀，放置6 min，再加10%硝酸铝溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min，后加5%氢氧化钠试液10.0 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min。以乙醇为参比，用1 mL比色皿，于紫外可见分光光度计上，在400～600 nm波长处进行扫描。结果表明，对照品溶液在510 nm处有最大吸收，因此选择510 nm作为测定波长。在510 nm波长处测定体系的吸收度，以吸收度（A）为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.2 蔓三七叶黄酮提取的流程

蔓三七叶粉末→一定浓度的乙醇浸泡→过夜→高压预均质（30 MPa，2次）→动态超高压微射流均质→乙醇冷凝回流提取（70 ℃，2次）→合并提取液→离心→抽滤→测定吸光度→计算黄酮得率。

1.2.3 蔓三七叶黄酮得率的计算

取0.5mL提取液，按照1.2.1的方法测定其在510 nm下的吸光度，按照式（1）计算黄酮的得率。

1.2.4 单因素实验

本实验中，提取温度、乙醇浓度、提取时间、提取次数、微射流均质压力、料液比等因素为影响蔓三七叶黄酮得率的主要因素。通过前期研究，确定液料比为15:1（mL: g），提取次数为2次。本实验主要研究提取温度、乙醇浓度、提取时间和微射流均质压力四个因素对蔓三七叶黄酮得率的影响。

1.2.5 正交实验设计

根据上述单因素的实验研究结果发现，乙醇浓度（A）、提取温度（B）、提取时间（C）、微射流均质压力（D）对蔓三七叶黄酮得率影响较大。因此，采用四因素三水平的正交试验方法对工艺条件进行优化，以类蔓三七叶黄酮得率为评价指标，设计方案见表1。

表1 正交实验因素水平表

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线

芦丁标准曲线回归方程为A=5.8579C+0.0012，R2=0.9996，在0～0.05 mg/mL范围内其吸光度值与浓度呈良好的线性关系。

2.2 单因素实验

2.2.1 乙醇浓度对蔓三七叶黄酮得率的影响

分别称取100.00 g干燥的蔓三七叶粉末（过20目），液料比15:1 (ml:g)，加入分别为50%、60%、70%、80%和90%浓度的乙醇，浸泡过夜，先经过30 MPa预均质后，在80 MPa微射流压力下处理2次，65℃水浴提取1.5 h，提取两次，结果如图1所示。

图1 乙醇浓度对黄酮得率的影响

由图1可知，在乙醇浓度为50%～70%范围内，蔓三七叶黄酮得率随着乙醇浓度的增加而增大，并且在乙醇浓度为70%时达到最大值，此时得率为1.93%；在乙醇浓度为70%～90%范围内，乙醇浓度继续上升，黄酮得率缓慢下降，在乙醇浓度为90%时，蔓三七叶黄酮得率为1.82%。蔓三七叶黄酮得率随着乙醇浓度的上升而下降，主要是因为当体系中的乙醇浓度大于70%后，物料中脂溶性杂质（如叶绿素）等大量溶解到体系中，从而降低了蔓三七叶黄酮的得率。因此，选择乙醇浓度为70%较合适。

2.2.2 提取温度对蔓三七叶黄酮得率的影响

分别称取100.00 g蔓三七叶粉末，按液料比15:1(ml:g)加入70%浓度的乙醇，浸泡过夜，经30 MPa预均质后，立刻在80 MPa微射流压力下处理2次，提取温度选择50、55、60、65 ℃和70 ℃水浴提取1.5 h，提取两次，结果如图2所示。

由图2可知，在提取温度为50～65 ℃范围内，蔓三七叶黄酮得率随着提取温度的上升而增加，且能显著影响蔓三七叶黄酮得率。在提取温度为50 ℃时，蔓三七叶黄酮得率为1.61%，而在提取温度为65℃时，蔓三七叶黄酮得率达到1.92%。但当温度超过65 ℃后，蔓三七叶黄酮得率随着温度的上升而缓慢下降，在提取温度为70 ℃时，蔓三七叶黄酮得率为1.87%，由于在高温下蔓三七叶黄酮中的某些在高温下易分解的活性成分被氧化分解，因此，用芦丁做标准品去测量产品中的蔓三七叶黄酮含量下降，从而影响了其得率。因此，选择提取温度为65 ℃较合适。

2.2.3 提取时间对蔓三七叶黄酮得率的影响

分别称取100.00 g蔓三七叶粉末，按液料比15:1 (mL:g)加入70%浓度的乙醇，浸泡过夜，经30 MPa预均质后，立刻在80 MPa微射流压力下处理2次，提取温度65 ℃水浴提取，提取时间选择0.5、1、1.5、2 h和2.5 h，提取两次，结果如图3所示。

由图3可知，蔓三七叶黄酮得率随着时间的延长先增加而后趋于平缓，在1.5 h内时，黄酮得率升高较快，而超过1.5 h后，黄酮得率变化不大。因此，选择提取时间为1.5 h较合适。

图2 提取温度对黄酮得率的影响

图3 提取时间对黄酮得率的影响

2.2.4 微射流均质压力对蔓三七叶黄酮得率的影响

分别称取100.00 g蔓三七叶粉末，按液料比15:1 (mL:g)加入70%浓度的乙醇，浸泡过夜，经30 MPa预均质后，分别在立刻微射流均质压力选择60、70、80、90 MPa和100 MPa下处理2次，提取温度65℃水浴提取1.5 h，提取两次，结果如图4所示。从图4可知，在微射流均质压力为60～90 MPa范围内，蔓三七叶黄酮得率随着微射流均质压力的增大而增加，在压力为90 MPa时达到最大值，得率达到1.94%。而后随着均质压力的进一步加大，蔓三七叶黄酮得率趋于平缓且略微下降。微射流均质后再提取时，使得蔓三七叶黄酮得率随着均质压力的上升而显著提高，其原因是均质压力越大，使得物料的细胞破碎程度越高，从而使得物料中有效成分黄酮类物质更完全地溶出。

图4 微射流均质压力对黄酮得率的影响

2.3 正交实验的结果与分析

从表2比较4个因素的极差R值，RA＞RC＞RB＞RA，即乙醇浓度＞提取时间＞提取温度＞压力，说明因素A对指标的影响最大。根据K值实验结果可见，最佳工艺组合为A3B2C3D2，即乙醇浓度80%、提取温度65 ℃、提取时间2.0 h、压力80 MPa。依照优化条件进行重复试验，此时蔓三七叶黄酮的得率为1.95%，提取率为94.8%。

表2 正交实验设计及结果

3 结论

本实验研究了动态超高压微射流对蔓三七叶黄酮得率的影响。通过正交实验法确定了微射流均质热醇提取蔓三七叶黄酮的最佳条件：乙醇浓度80%、提取温度65 ℃、提取时间2.0 h、微射流均质压力80 MPa、微射流均质次数2次、液料比15:1 (ml:g)、提取次数2次。此时，蔓三七叶黄酮的得率为1.95%。