蒋德意

(润盈生物工程（上海）有限公司，上海 201700)

乳酸菌是人体正常菌群之一，具有平衡肠道环境、提高免疫力、抗肿瘤、维持心血管健康等重要生理功能，与人体健康息息相关[1-3]。嗜酸乳杆菌以较强的耐酸耐胆盐特性成为乳酸菌家族中极为重视研究和开发的益生菌，被广泛应用于发酵食品和微生态制剂[4]。乳酸菌的生理功能是否能在人体中体现出来，除了与其能否顺利到达肠道有关外，还与其是否能定植在肠道中有很大关系。因此本文研究嗜酸乳杆菌LA-G80在肠道中的定植能力，为以后的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株

嗜酸乳杆菌LA-G80（L. acidophilus LA-G80），由润盈生物工程（上海）有限公司菌种保藏中心保存。

1.1.2 实验动物

实验SD大鼠由浙江省实验动物中心提供，实验动物饲料由浙江省实验动物中心提供，保持温度（22±2）℃，湿度（56±5）%，每3天换1次锯末。控制12 h光照，12 h黑暗的循环标准，每天上午7点开灯。实验大鼠在试验期间给予自由饮水和自由采食，体重每3天检测一次。在进行试验前，均先给予1周的适应期，适应期内饲喂基础饲料[5-6]。

1.1.3 实验试剂

细菌基因组DNA小提试剂盒，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；粪便基因组DNA试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.4 实验样品

样品为在洁净环境下生产的嗜酸乳杆菌LA-G80粉末，浅黄色，铝箔袋包装。

1.2 方法

1.2.1 灌胃液制备

用生理盐水稀释样品至所需的菌浓度，实验高剂量组1.0×1010CFU/mL，实验低剂量组5.0×108CFU/mL，对照组为生理盐水。

1.2.2 大鼠灌胃

实验设3个组，每组15只大鼠，按1 mL/100 g（菌液体积/鼠体重）灌胃，每天早上9点定量灌胃1次，连续灌胃7天。灌胃期间除定点灌胃外，正常饲喂常规饲料。于灌胃阶段的初始，停止灌胃1天、3天、5天、7天、9天和11天采集大鼠粪便，装于无菌5 mL EP管中，于-40 ℃保存。

1.2.3 嗜酸乳杆菌LA-G80的特异性引物设计

提取嗜酸乳杆菌LA-G80的全基因组，采用上海生工生物革兰氏阳性细菌基因组DNA小提试剂盒抽提。提取后的基因组经16S rRNA鉴定[7]是嗜酸乳杆菌LA-G80无误。

使用引物 p514（5'-TGGATCACCTCCTTTCTA-3'）和 p675（5'-GTGCGCCCTTTATTAACTT-3'）[8-9]对全基因组ISR区域进行扩增。扩增条件为：94 ℃预变性 3 min，94 ℃变性 30 s，45 ℃退火 30 s，72 ℃延伸60 s，30个循环。将扩增产物用核酸电泳胶验证，将PCR产物大片段进行胶回收，并将纯化回收后的片段序列进行测定。将测定得到的片段序列与NCBI数据库比对，选定差异性最大的区域作为种特异性片段，嗜酸乳杆菌LA-G80种特异性片段长度为500 bp，并根据菌的同特异性片段设计种特异性引物。

1.2.4 外标准品制备及标准曲线制作

同时将种特异性片段与pEasy-T1 Simple质粒连接，并转化入感受态细胞DH5α中。经过菌落PCR验证，提取质粒即为标准品，并通过Real-time quantitative PCR制作标准曲线。

1.2.5 Real-time quantitativePCR测定粪便中菌含量

采用天根生化科技公司粪便基因组DNA试剂盒抽取粪便中的全基因组。将待测粪便样品DNA抽提液按与制备标准曲线相同的反应体系和反应条件进行Real-time quantitative PCR反应，扩增完毕后，进行溶解曲线分析，并根据标准曲线计算出粪便样品中嗜酸乳杆菌LA-G80的含量。

2 结果与分析

2.1 扩增曲线与灵敏度测定

图1为不同浓度嗜酸乳杆菌LA-G80作Realtime PCR后显示的荧光定量扩增曲线。可以看出，不同拷贝数的模板随循环数的增加，其荧光强度逐渐增强，在经过指数扩增期后曲线趋于平行，即出现平台效应，指数扩增期模板拷贝数与荧光累积值的一一对应关系形成了嗜酸乳杆菌LA-G80定量的基础。从扩增曲线图可见少至100个菌仍有特征性曲线生长，说明该Real-time PCR具有较好的灵敏度。

图1 嗜酸乳杆菌LA-G80 l06～102拷贝的模板循数与荧光强度关系图

2.2 嗜酸乳杆菌LA-G80标准曲线

以不同拷贝数的阳性模板的对数为横坐标，以PCR反应过程中到达荧光阈值的初始循环数（Ct）为纵坐标得到嗜酸乳杆菌LA-G80的标准曲线如图2所示，为待测样品的嗜酸乳杆菌LA-G80定量提供了参照标准。本实验采集了5个浓度梯度的标准曲线。

图2 嗜酸乳杆菌LA-G80标准曲线图

2.3 溶解曲线与假阳性

模板在荧光定量PCR反应的后期，产物经溶解、冷却后得到溶解曲线如图3，可见溶解曲线成单峰，说明扩增产物单一，与SYBR GreenⅠ荧光染料结合的为目标DNA片断，该反应条件较好地避免了定量检测过程中假阳性结果的出现。

图3 扩增产物溶解曲线

2.4 大鼠粪便中嗜酸乳杆菌LA-G80定量结果

各实验组大鼠粪便内嗜酸乳杆菌LA-G80定量结果见图4。结果显示，灌胃生理盐水的对照组其检出的嗜酸乳杆菌LA-G80含量随时间变化很小，这很好地说明了设计的种特异性引物的特异性良好，并表明此种检验方法的有效性良好。灌胃菌液的粪便样品中都有检出嗜酸乳杆菌LA-G80的存在，灌胃高剂量组菌液大鼠的粪便中菌含量比灌胃低剂量组菌液大鼠粪便中菌含量要高一个数量级，这与灌胃液高剂量组比低剂量组菌浓高相符合。

图4 嗜酸乳杆菌LA-G80定植能力

如图4所示，在停止灌胃1天后，粪便样品中嗜酸乳杆菌LA-G80含量均达到最高值，且与各灌胃剂量相符合。随着停止灌胃后时间的延长，粪便样品中菌含量总体上呈现减少的趋势。在停止灌胃3天时，粪便样品中嗜酸乳杆菌LA-G80比初始灌胃剂量降低2个数量级。在停止灌胃3～5天时，粪便样品中嗜酸乳杆菌LA-G80含量降低很小，基本保持稳定，且在停止灌胃7天时，仅下降1个数量级，仍可保持约105CFU/g，直到停止灌胃9天后菌含量才降至对照组水平。

3 结论

通过灌胃大鼠，采集不同停止灌胃后时间的大鼠粪便，并应用Real-time PCR方法快速、准确地对粪便样品进行嗜酸乳杆菌LA-G80的定量，从而研究了嗜酸乳杆菌LA-G80的肠道定植能力。研究发现在停止灌胃1天后，粪便样品中嗜酸乳杆菌LA-G80含量达到最高值，且与各灌胃剂量相符合。在停止灌胃3～5天时，粪便样品中嗜酸乳杆菌LA-G80含量降低很小，基本保持稳定，且在停止灌胃7天时，仅下降1个数量级，仍可保持约105CFU/g，直到停止灌胃9天后菌含量才降至对照组水平，说明嗜酸乳杆菌LA-G80有较好的肠道定植能力，且定植时间约为9天。这可能是由于嗜酸乳杆菌LA-G80本来自于肠道，且对酸有良好的耐受性，而乳酸菌在肠道中定植的首要条件是穿过胃部并保持较大的活菌数，进而在小肠定植，胃部的强酸环境会使不耐酸的乳酸菌大量死亡，而嗜酸乳杆菌LA-G80的良好酸耐受性可使其在进入胃部后仍能保持高存活率，并保持高活菌数进入小肠，进而在小肠定植，发挥益生功能。