吴晓牧 曾玉娥 杨海玉

大脑是酒精诱导损伤的最常见靶器官之一，长期大量饮酒可引起脑器质性损害，并逐渐发展至痴呆状态。酒精性痴呆（alcohol-associated dementia，AAD）是指由于长期饮酒导致慢性脑器质性损害而出现记忆缺损并伴有一种或一种以上认知功能受损的精神行为异常，同时可伴有震颤、谵妄、痉挛发作等神经功能障碍，记忆受损是其最重要和最基本的特征［1］。研究结果显示酒精中毒已成为诱导痴呆发病的重要因素，AAD患者可占痴呆发病人群的21%～24%［2］。酒精可通过神经细胞毒性、氧化应激反应等途径直接或间接诱导神经细胞发生凋亡，致使海马区功能性神经细胞数目减少，从而导致学习记忆功能发生不完全可逆性损害［3］。目前，酒精诱导海马损伤致学习记忆功能障碍的动物模型是用于研究AAD的公认模型。但在建立AAD动物模型的研究中，关于酒精作用的途径、剂量和时间尚无统一标准，对动物模型的评价效果也各不相同［4－5］。本研究通过采用不同酒精干预途径、剂量和时间建立AAD大鼠模型，并观察大鼠行为学、海马组织形态学变化以及神经细胞凋亡情况，旨在探讨建立AAD动物模型的最佳方法。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组 8周龄清洁级SD雄性大鼠53只，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司（合格证号：HNASLKJ20102186），体质量180～220g，按完全随机区组法分为生理盐水灌胃组〔n＝13，分为生理盐水灌胃A组（n＝6）和B组（n＝7）两个亚组〕、低剂量酒精灌胃组〔n＝18，分为低剂量酒精灌胃A组（n＝11）和B组（n＝7）〕、高剂量酒精灌胃组（n＝7）、生理盐水腹腔注射组（n＝7）和酒精腹腔注射组（n＝8）。

1.2 方法

1.2.1 AAD模型的建立［5］：（1）低剂量酒精灌胃A组（n＝11）大鼠按体质量4mL／kg给予20%（体积分数）酒精灌胃，1次／d，连续28d；生理盐水灌胃A组（n＝6）给予等量生理盐水灌胃。（2）低剂量酒精灌胃B组（n＝7）和高剂量酒精灌胃组（n＝7）大鼠分别按体质量4、12mL／kg给予20%（体积分数）酒精灌胃，1次／d，连续14d；生理盐水灌胃B组（n＝7）给予等量生理盐水灌胃。（3）酒精腹腔注射组（n＝8）大鼠按体质量4mL／kg腹腔注射20%（体积分数）酒精，1次／d，连续14d；生理盐水腹腔注射组（n＝7）给予等量生理盐水腹腔注射。于每天给予酒精或生理盐水之前称体质量。

1.2.2 AAD模型的评价：（1）一般状况观察：每天观察记录大鼠的精神状态、活动、睡眠、饮食、毛发和大小便情况。（2）Morris水迷宫（Morris water maze，MWM）行为学检测［6］：检测动物从入水至寻找到平台的时间，即逃避潜伏期（escape latency，EL），并以此作为衡量动物学习记忆能力的标准。实验规定大鼠最长游泳时间为60s，如动物在60s内找不到平台，则将其引导至平台停留20s，记录该次EL为60s。所有大鼠在开始给药前均接受训练5d。生理盐水灌胃A组和低剂量酒精灌胃A组大鼠分别于灌胃7、14、21、28d后进行MWM行为学检测；生理盐水灌胃B组、低剂量酒精灌胃B组、高剂量酒精灌胃组、生理盐水腹腔注射组和酒精腹腔注射组大鼠于灌胃14d后进行MWM行为学检测。每只动物以3次游泳成绩（分别从3个入水点记录）的平均值作为该动物的EL。

1.2.3 大鼠海马组织苏木素－伊红（Hematoxylin-Eosin，HE）染色：将生理盐水灌胃B组、低剂量酒精灌胃B组、高剂量酒精灌胃组、生理盐水腹腔注射组和酒精腹腔注射组大鼠于14dMWM行为学检测之后处死取脑。给予浓度为10%（体积分数）的水合氯醛（批号：赣药制字H20090014，江西省人民医院药剂科）腹腔注射麻醉大鼠，以40g／L多聚甲醛（批号：XK13-201-00153，上海润捷化学试剂有限公司）灌流固定，之后取全脑以40g／L多聚甲醛固定24h，然后选取海马部位切取厚度为2 mm的脑片，经脱水、透明、石蜡包埋，切取厚约4～6μm切片进行常规HE染色，光镜下观察海马组织形态结构改变。

1.2.4 大鼠海马神经细胞凋亡检测：选取大鼠海马区进行组织切片，经脱蜡、水化处理后用PBS洗3次，然后每张切片滴加适量Hoechst33342染色液（货号C1025，碧云天生物技术研究所）覆盖组织，避光染色10min，PBS洗3次后封片，采用荧光显微镜（型号DM3000，德国徕卡公司）20倍镜下观察取图。每只大鼠各选取1张切片，在每张切片双侧海马的海马齿状回（dentate gyrus，DG）和CA1区分别随机选取3个视野，并进行凋亡神经细胞计数。凋亡细胞的特征表现为细胞核呈明显固缩、浓染。

1.3 统计学处理 采用SPSS 20.0统计软件进行统计分析，数据以均数±标准差表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较选择LSD检验（方差齐性）和Dunnett T3检验（非方差齐性）；两均数间比较则采用t检验。取α＝0.05。

2 结果

2.1 行为学及体质量比较 高剂量酒精灌胃组大鼠精神状态、活动能力及饮食等均较生理盐水灌胃组和低剂量酒精灌胃组差。与生理盐水灌胃组相比，高剂量酒精灌胃组14d后大鼠平均体质量明显下降〔（259.57±3.22）gvs.（279.33±5.56）g，P＝0.03〕，而低剂量酒精灌胃组大鼠的体质量无明显改变〔（278.10±3.94）g，P＝0.83〕。

2.2 MWM检测结果 与生理盐水灌胃A组相比，大鼠在给予低剂量酒精灌胃14d和28d后，其EL时间均显著延长（表1）。生理盐水组灌胃A组大鼠经过多次MWM行为学检测后，其EL时间呈逐渐下降趋势，而低剂量酒精灌胃组则无明显改变（表1）。与生理盐水灌胃B组相比，低剂量酒精灌胃B组大鼠的EL时间明显延长〔（18.92±4.85）svs.（5.34±1.15）s，P＝0.02〕，而高剂量酒精灌胃组大鼠的 EL时间〔（9.55 ±2.30）s〕虽表现为延长趋势，但结果并无统计学差异（P＝0.13）。酒精腹腔注射组大鼠14d后其EL时间较生理盐水腹腔注射组延长〔（12.49±2.82）svs.（5.31±0.85）s，P＝0.04〕。

2.3 海马HE染色观察结果 生理盐水灌胃B组大鼠DG和CA1区细胞结构清晰、完整，形态均一，细胞核未见异形、浓染等异常改变；而低剂量酒精灌胃B组大鼠海马DG和CA1区可见大量散在分布的异常细胞，胞核固缩变形、浓染，细胞层数和密度均明显减少（图1）。高剂量酒精灌胃组和酒精腹腔注射组大鼠海马DG和CA1区也可见到一些散在分布的异常细胞，而生理盐水腹腔注射组未见异常。

2.4 海马神经细胞凋亡检测 生理盐水灌胃B组大鼠海马DG和CA1区细胞结构完整、形态均一，未见异形浓染凋亡细胞；而低剂量酒精灌胃B组大鼠海马DG和CA1区可见大量聚集分布的异形、碎片状致密浓染凋亡细胞（图2）。与生理盐水灌胃B组相比，低剂量酒精灌胃B组大鼠海马DG区凋亡神经细胞数量（73.00±9.17vs.16.00±0.89，P＜0.01）和 CA1 区凋亡神经细胞数量（32.67±5.06vs.9.50±2.18，P＜0.01）均明显增加；高剂量酒精灌胃组大鼠海马DG区凋亡神经细胞数量（54.33±14.52）亦较生理盐水灌胃B组DG区增加（P＜0.05），而CA1区凋亡神经细胞数量（21.17±3.10）虽有一定程度增加，但无统计学差异（P＞0.05）。与生理盐水腹腔注射组相比，酒精腹腔注射组大鼠海马 DG区（52.67±23.50vs.14.33±1.76，P＝0.18）和 CA1区（10.67±2.03vs.11.67±0.88，P＝0.67）的凋亡神经细胞数量无明显改变。

表1 各组大鼠MWM检测EL比较 （±s，s）

表1 各组大鼠MWM检测EL比较 （±s，s）

注：与生理盐水灌胃A组相比，＊P＜0.05；与同组0d相比，＃P＜0.05

组别 n 0d 7d 14d 21d 28d F值 P值3.66 0.03低剂量酒精灌胃 A组 11 8.36±1.00 8.10±1.42 24.70±5.43＊ 12.59±2.78 8.15±1.07＊生理盐水灌胃A组 6 9.44±1.30 10.42±2.06 5.68±1.30 6.82±2.55 4.52±1.14＃8.01 1.00

图1 各组大鼠海马组织HE染色结果

图2 酒精诱导大鼠海马神经细胞凋亡检测结果（Hoechst33342染色）

3 讨论

该研究结果显示，低剂量酒精灌胃14d后大鼠即可表现明显的学习记忆损害；而高剂量酒精灌胃虽然具有同样的趋势，但与生理盐水灌胃组比较并无统计学差异。同时，该研究还发现高剂量酒精灌胃组大鼠体质量增长、精神状态、活动能力及饮食等均差于生理盐水灌胃组和低剂量酒精灌胃组，提示酒精剂量过高可能严重影响机体其他系统的功能，例如酒精可直接损害胃肠道黏膜结构，进而影响胃肠道消化吸收等生理功能等。尽管高剂量酒精灌胃对海马形态结构及神经细胞凋亡有一定损伤，但作者仍认为建模时不宜采取过高的酒精剂量和浓度。另外，虽然本研究结果显示酒精腹腔注射亦可使大鼠EL时间显著延长，但是从海马神经细胞凋亡检测结果来看，酒精腹腔注射的作用效果不明显，提示酒精灌胃方法更适宜建立AAD模型。生理盐水灌胃组大鼠在经过多次游泳训练学习之后，其EL呈明显缩短趋势，提示动物学习记忆能力逐步增强；然而，低剂量酒精灌胃组大鼠并未发现该现象。研究表明动物经过学习训练可引起改变脑内突触结构和功能的可塑性变化，而这种变化是增强动物学习记忆能力的重要分子机制。Xu等［7］研究发现学习可引起动物脑内新的突触结构快速形成，并且重复训练可以使新形成的突触结构变得更加稳定，训练结束后也能持续较长时间。Yang等［8］也研究证实小鼠进行运动技能训练后3个月，即使30%～40%新形成的突触结构丢失，依然能维持先前学习的运动技能，且新形成的突触存在越多，动物的记忆力越强，行为表现也越好。以上研究结果提示酒精可能通过影响突触可塑性而干预学习记忆形成过程，其具体机制尚待进一步研究。

大量研究证实长期慢性饮酒可促使海马体积减小及海马区大量神经细胞凋亡，该机制与酒精诱导空间学习记忆功能障碍的发生密切相关。Oliveira-da-Silva等［9］对 出 生 后 30d 至 45d 的C57BL／6小鼠给予腹腔注射酒精发现，酒精作用可导致海马大部分区域（包括齿状回颗粒层及分子层、CA1、CA2和CA3区）的凋亡细胞数目增加，而且神经元及胶质细胞密度明显减少。Vongvatcharanon等［10］对3月龄雌性成年Vistar大鼠给予低浓度和高浓度酒精作用3周至半年发现，各组大鼠海马区和扣带回皮质氨酪酸能神经元减少和神经小胶质细胞增加，并且这种改变随着饮酒时间的延长而增加。同样，该研究结果也证实酒精作用可破坏大鼠海马正常形态结构，诱导神经细胞发生凋亡，致使海马神经细胞数目明显减少，提示这些组织学改变与酒精损害学习记忆功能机制密切相关。

综上所述，该研究建立的AAD动物模型不仅具有行为学和海马组织学的明显改变，而且在一定程度上反映了AAD的发病机制和功能变化规律。

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