蔡振陆 冯韵然 李星星 李牧 吕海侠

[摘要] 目的 探討绿茶水浸出物对发育期神经细胞存活和增殖的影响。 方法 选取PC12细胞作为毒理学研究的模型，将绿茶于去离子水中100℃连续煮沸3次，留取各次煮沸后的水溶液进行过滤及冷冻干燥，继而以40倍体积无菌纯水溶解，制备绿茶水浸出物。以DMEM培养基对绿茶水浸出物进行100、200、400、800和1600倍稀释，用于处理PC12细胞。通过观察细胞形态、绘制细胞生长曲线、CCK-8试剂盒检测细胞活力、流式细胞仪检测分析细胞凋亡，Ki67免疫细胞化学染色观察细胞增殖，分析绿茶水浸出物对PC12细胞的影响。 结果 与低浓度（800倍及1600倍稀释）绿茶比较，较高浓度（100稀释）绿茶处理后，PC12细胞贴壁能力下降，死细胞碎屑明显增多，活细胞数量及细胞活力较对照组明显下降（P < 0.05），Ki67阳性细胞比例显著降低（P < 0.05），但细胞凋亡比率与对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 高浓度绿茶对PC12细胞的存活和增殖有显著抑制作用，建议孕期尽量减少饮用浓茶。

[关键词] 绿茶水浸出物；PC12细胞；存活；凋亡；增殖

[中图分类号] R715.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）05（c）-0004-04

Effect of water extraction of green tea on survival and proliferation of PC12 cells

CAI Zhenlu1 FENG Yunran2 LI Xingxing1 LI Mu3▲ LV Haixia1

1.Institute of Neurobiology， Xi′an Jiaotong University Health Science Center， Shaanxi Province， Xi′an 710061， China；2.the Affiliated Middle School of Shaanxi Normal University， Shaanxi Province， Xi′an 710061， China；3.Department of Obstetrics and Gynecology， the Second Hospital of Xi′an Jiaotong University， Shaanxi Province， Xi′an 710004， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of green tea on the survival and proliferation of neural cells during development. Methods PC12 cells were selected as the cell model for toxicological analysis， green tea leaves were boiled in distill water of 100℃ for three times， tea solution was then filtered and freeze dried. The powder was dissolved with sterilized pure water. DMEM medium was applied to make different concentrations of tea extraction （diluer for 100， 200 400， 800， and 1600 times） before use. The morphology of PC12 cells was observed， cell viability and apoptosis were detected by CCK-8 assay and flow cytometry assay after treatment. The proliferation of PC12 was detected by Ki67 immunostaining. Results Compared with low concentration （diluer 800 and 1600 times）， after treated with green tea extraction in high concentration， PC12 cell morphology changed dramatically and cell viability was decreased significantly （P < 0.05）. Proliferation of PC12 also declined dramatically， as showed by the reduced number of Ki67+ cells （P < 0.05）. While the apoptosis of PC12 had no statistically significant difference compared with control group （P > 0.05）. Conclusion Green tea in high concentration， so it is recommended to reduce the drinking of strong green teadurn pregancy could reduce the survival and proliferation of PC12 cells

[Key words] Water extraction of green tea； PC12 cells； Survival； Apoptosis； Proliferation

中国传统的茶文化源远流长，茶水也已成为中国人群普遍接受的饮品。茶叶中含有茶多酚、茶多糖、茶蛋白、生物碱等成分，已被证实具有抗氧化、抗癌等功效[1-6]，备受食品界和医学界的重视。然而妊娠期妇女是否可以饮茶？茶水对胚胎发育尤其是神经系统发育会产生怎样的影响？一直是困扰妇产科医生和妊娠妇女的难题。有实验证实绿茶有对抗神经损伤的作用[7-8]，然而Ye团队[9]对北方人群饮茶和胎儿神经管畸形的发生率之间的关系调查结果证实，围妊娠期间持续每日饮茶者其胎儿发生神经管缺陷的风险明显增高。究竟饮用茶水是否会影响神经系统的发育？茶水会对神经细胞产生怎样的影响仍值得探讨。

绿茶属于不发酵茶叶，已经被证实在抗氧化应激损伤以及抗肿瘤等方面发挥重要的作用[1-4，6-8]。本研究选取绿茶作为研究对象，以开水煮沸的方式模拟日常生活中的茶叶冲泡过程。选取大鼠嗜铬细胞瘤系PC12细胞为神经毒理研究模型，观察不同浓度的绿茶处理后细胞的存活、凋亡以及增殖情况，分析饮茶对发育期神经系统的可能影响，以期为指导临床实践提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料与实验试剂

PC12细胞系够自美国ATCC细胞库，由西安交通大学医学部神经生物研究所保存。绿茶为市售流行品牌。胰蛋白酶、DMEM（高糖）培养基、胎牛血清（（FBS））购自Gibco公司；CCK-8试剂盒购自七海复泰生物科技有限公司；小鼠抗大鼠Ki67单克隆抗体购自Abcam公司（1∶500）、TRITC标记二抗购自北京中杉金桥生物科技有限公司；Hochest33258染液及DAPI购自中国碧云天生物科技有限公司。磷酸盐缓冲液（PBS）以及4%多聚甲醛由本实验室配制。

1.2 实验方法

1.2.1 不同浓度茶叶水浸出物制备 称取绿茶干茶叶5.0 g，加入200 mL去离子水，100℃条件下煮沸30 min，每5分钟晃动1次。连续提取3次后静置，待颗粒物沉淀，取上清液进行过滤，并于40℃条件下真空干燥。使用前以50 mL灭菌去离子水复溶，取200 μL原液稀释至1 mL，以0.22 μm微孔滤膜过滤，以DMEM培养基进行100、200、400、800和1600倍稀释，用于处理PC12细胞。

1.2.2 PC12细胞培养及处理 按常规方法将PC12细胞培养于含10% FBS的DMEM培养液中，5% CO2、37℃条件下培养，待细胞生长至80%～90%汇合时用0.25%胰蛋白酶消化传代。传代细胞进入对数生長期后，于培养环境中加入不同浓度的绿茶水浸出物，对照组添加等量培养基。

1.3 PC12细胞活力检测

PC12细胞传代接种于96孔培养板，每孔3000个细胞，对进入对数生长期的PC12细胞给予不同浓度的绿茶水浸出物处理。倒置相差显微镜下观察细胞形态，连续进行细胞计数并绘制生长曲线；与此同时，于处理后不同时间点，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，37℃孵育50 min，用BIO-RAD680型酶标仪（美国）测定波长450 nm处的吸光度（OD值）。参考以下公式计算细胞存活率：细胞存活率=（实验组OD-空白组OD）/（对照组OD-空白组OD）×100%。每组实验至少重复3次。

1.4 PC12细胞凋亡及增殖能力检测

同上处理PC12细胞，以流式细胞仪检测细胞凋亡情况；部分细胞传代于预先经过多聚赖氨酸包被的玻片，置96孔培养板继续培养3 d后进行Ki76免疫细胞化学染色，观察细胞增殖情况。

1.5 免疫细胞化学染色

PC12细胞以4%多聚甲醛室温固定20 min，固定后细胞经PBS洗涤3次，以5%正常山羊血清封闭，甩掉不洗，继而与1∶500稀释的单克隆Ki67抗体室温孵育30 min后于4℃过夜，次日经室温复温2 h、PBS洗涤3次后滴加TRITC标记二抗，室温避光孵育2 h，以含有DAPI的封片剂进行封片，荧光显微镜下观察并计数阳性细胞。阴性对照组以含5%正常山羊血清的PBS代替一抗，分别选取3张染色后玻片，每张玻片计数3个视野，计算阳性细胞占细胞总数百分比。每组实验至少重复3次。

1.6 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 绿茶水浸出物对PC12细胞生长的影响

正常培养条件下，PC12以贴壁状态生长，细胞轮廓清晰，胞体和突起折光性强；低浓度（800倍稀释）绿茶水浸出物处理后细胞形态变化不大，而高浓度（100倍稀释）绿茶水浸出物处理后细胞贴壁能力下降，死细胞碎屑明显增多，与对照组比较细胞数量显著减少（图1）；生长曲线显示高浓度绿茶水浸出物处理后PC12细胞数量随培养时间的延长没有明显增加（图2），与对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.01）。

2.2 绿茶水浸出物对PC12细胞活力的影响

以不同浓度绿茶水浸出物处理PC12细胞，CCK-8检测结果显示：高浓度绿茶（0～100倍稀释）浸出物处理细胞后，细胞活力[OD值：0.30±0.01）]与对照组（0.50±0.08）比较显著下降，差异有统计学意义（P < 0.05）。相对而言，以中、低浓度绿茶（200～800倍稀释）处理PC12细胞，细胞活力（0.46±0.08、0.45±0.07、0.48±0.06）与对照组比较无明显变化，差异无统计学意义（P > 0.05）（图3）。

2.3 绿茶水浸出物对PC12细胞凋亡的影响

流式细胞仪检测不同浓度的绿茶水浸出物处理后PC12细胞凋亡情况，结果显示：对照组细胞凋亡比率为（3.7±0.59）%，高浓度绿茶水浸出物处理后PC12细胞凋亡率为（5.24±1.05）%，两组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见图4。

2.4 綠茶水浸出物对PC12细胞增殖的影响

免疫细胞化学染色的方法观察茶叶水浸出物处理后细胞增殖的变化，结果显示：高浓度绿茶水处理组（图5B，封四），Ki67阳性细胞（正在增殖的细胞）比率为（33.5±2.89）%，与对照组[（79.8±3.95）%，图5A，封四]比较显著下降，差异有统计学意义（P < 0.05）。

3 讨论

茶叶中富含多种营养成份，本实验选用未发酵的绿茶，以煮沸方式获取其浸出物，能更好地模拟日常生活中的茶叶浸泡。已经证实未发酵茶叶经过热水浸泡后其浸出物以茶多酚和嘌呤类的生物碱为主，而茶多酚有明确的神经保护作用，可以显著减轻谷氨酸对PC12细胞的兴奋性神经毒性[10-13]，对于母亲患糖尿病引起的神经管畸形有缓解作用[8]。本实验为了更好地模拟正常妊娠妇女饮茶，未对细胞做损伤性处理，即重点观察绿茶水浸出物对正常培养的PC12细胞的影响，具有较高的指导意义。

PC12细胞系源于大鼠嗜铬细胞瘤，已被广泛用于神经系统细胞模型[12-20]。本研究观察不同浓度绿茶水浸出物对PC12细胞存活、凋亡以及增殖等生物学行为的影响，用于分析绿茶对发育中神经系统细胞产生的可能影响。Menezes等[7]的研究证明饮茶可以缓解动物因母婴分离而引起的认知功能障碍，发挥积极的作用，而Ye等[9]的研究认为茶叶中的茶酸成分可能通过抑制二氢叶酸还原酶的活性而干扰叶酸的代谢，并抑制叶酸在肠道的吸收，从而引起神经管发育异常。发育期大脑神经细胞对外界因素的影响极为敏感，绿茶中的多种成分可能通过不同的途径影响神经细胞的行为[1，4，12，16]，从而对神经发育产生影响。本研究结果显示当高浓度绿茶水浸出物处理PC12细胞后，细胞活力以及增殖能力显著下降，而凋亡细胞比率无显著性差异，相对来讲，淡茶水对PC12细胞行为的影响和对照组比较，差异无统计学意义。上述结果提示孕期妇女如果饮用高浓度绿茶，茶多酚可能通过影响神经细胞的存活和增殖从而影响神经系统的正常发育，必须谨慎。相对而言，低浓度绿茶对细胞的存活和增殖无明显的影响，相对安全。因此，我们建议妊娠妇女在孕期尽量减少茶水的饮用，如果需要，尽可能以淡茶为主。

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（收稿日期：2018-01-29 本文编辑：任 念）