董小娜，陈泽慧，毛林强，王明新，张文艺

(常州大学 环境与安全工程学院，江苏 常州 213164)

每年夏秋季一些水体均发生有害藻华(HAB)暴发，给水环境生态带来极大威胁，探索行之有效的溶藻方法迫在眉睫。利用溶藻菌(algicidalbacteria)溶藻安全高效，具有广阔前景。近年来,学者们在溶藻菌的筛选、溶藻活性代谢产物分析、溶藻微生物的溶藻机理等方面的研究相当活跃，包括溶藻菌株的分离鉴定、溶藻性质的描述、溶藻方式的探讨、溶藻活性物质的分离与纯化[1-2]以及溶藻机理的研究等。尤其溶藻机理的研究更是深入到基因水平(分子水平)：藻细胞的细胞水平[3-4]、功能酶和蛋白水平[5-6]等。近年来溶藻菌的筛选成果颇多[7]，已分离鉴定出来的菌属有粘细菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属等[8]，因藻类的暴发与溶藻菌的生长息息相关，这些溶藻菌多来自藻华频繁暴发地带。细菌溶藻方式主要有2种：直接溶藻与间接溶藻，见诸报道的溶藻菌多具有间接溶藻特性[9]。对溶藻能力的测定方法有：藻细胞数量的变化、chl-a含量的变化及其采用藻胆蛋白(某些藻类如蓝藻)的含量变化等。对溶藻机理的研究越来越多，众多分析方法被用于揭示溶藻产物溶藻机理，如：傅里叶红外光谱、荧光光谱、透射电镜等[10]。细菌分泌的物质(如氨基酸、抗生素、多肽等)[11]成分复杂，不同的溶藻菌分泌有效溶藻成分也不尽相同，这让溶藻活性物质的分离纯化非常困难，目前分离纯化出有效溶藻物质罕见报道。报道的溶藻活性物质的分离纯化主要有2种方法：硅胶柱层析[12]与高效液相色谱(HPLC)方法[13]。对活性物质的鉴定方法有液质联用(LC-MS)[13]、液相二级质谱(LC-MS-MS)等。但这还仅仅只是限于实验室研究阶段，在实践中直接利用的效果并不理想，其活性物质的分离纯化困难且收集率低，这使得生物菌剂投产与使用都难以实现。

采用三维荧光技术对藻胆蛋白的测定来表征溶藻效果，借助三维荧光光谱解析溶藻降解产物；通过对菌液进行热处置、破碎处置、酸碱处置、透析处置等手段研究了菌株R1 Lysinibacillus macroides的溶藻机理；并通过HPLC技术初步分离提取了有效溶藻物质。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 藻种来源：铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)购自中国科学院武汉水生生物研究所。

菌种来源：从太湖激浪鱼内脏(鱼鳃、鱼肠等)中筛选出了1株溶藻效果较佳的菌株R1，培养2 d后，菌落呈圆形，直径大约1～2 mm，白色，表面光滑，微微凸起，边缘光滑，生长快速；革兰氏染色呈紫色,为阳性菌(如图1)，经生理生化及16S rDNA序列分析，其与Lysinibacillusmacroides相似性最高，达99.50%。

图1 R1革兰氏染色

1.1.2 主要仪器和试剂 1)试剂：试剂均为中国产分析纯试剂。

2)仪器：离心机、超声波细胞粉碎机、高压蒸汽灭菌锅、倒置显微镜、岛津紫外分光光度计UV-1800、Cary Eclipse荧光分光光度计等。

1.1.3 培养基及其他试剂 LB培养基[14]、铜绿微囊藻培养基BG-11[15]

1.2 方法

1.2.1 菌株溶藻能力考察 为探索菌株R1的溶藻效果，取10 mL培养24 h的R1菌液接种到100 mL铜绿微囊藻溶液中(初始chl-a含量为205.11 mg/L)，27 ℃、光暗比12 h∶12 h周期下培养，每天定期手动摇晃2～3次，每隔2 d测得chl-a含量变化，通过式(1)[16]计算溶藻率并绘制曲线，同时做空白对照。

η=(Cc-Ct)/Cc×100%

(1)

式中：η为溶藻率,%；Cc为初始chl-a含量,mg/L；Ct为后期chl-a含量,mg/L。

1.2.2 三维荧光考察溶藻效果 通过测定chl-a含量的方法考察溶藻效果较为繁琐，测定时间较长，且需要耗费许多提取物；使用显微镜观察藻细胞形态数量是最传统的浮游藻类分析方法，该方法工作量大，比较繁琐，且有时辨别不清[17]。铜绿微囊藻有很强的荧光特性的藻胆蛋白，是一种卟啉类色素蛋白，卟啉具有π电子结构[9]，在特定的波长照射下有很强的荧光反应。荧光光谱分析方法快速、准确、样品不需要特别处置、简单高效。铜绿微囊藻细胞具有如下荧光特性：藻密度与发射波长无关[18]，在低浓度下，荧光强度与溶液浓度成正比，可进行定量分析[18-20]。

为表征菌株溶藻过程，对菌藻混合液(参照1.2.1)进行了三维荧光谱图分析，取菌藻混合液，进行三维荧光扫描，发射波长(简称Em)280～900 nm/280～550 nm，激发波长(简称Ex)220～800 nm/220～400 nm；狭缝宽度为5 nm；

每隔一段时间收集混合液测Em为650 nm的三维荧光光谱，通过式(2)[21]计算溶藻率并绘制曲线。

η=(Fc-Ft)/Fc×100%

(2)

式中：η为溶藻率，%；Fc为藻胆蛋白初始光强，A.U；Ft为后期藻胆蛋白的光强，A.U。

1.2.3 三维荧光图谱EMMs结合平行因子分析考察溶藻产物 为表征菌株溶藻产物，对降解后的藻液进行了三维荧光谱图分析，发射波长(简称Em)280～550 nm，狭缝宽度为2 nm；激发波长(简称Ex)220～400 nm；狭缝宽度为5 nm；同时，考察纯藻液及其菌液的荧光特性。EEMs分析物质鉴定，主要采用目视鉴定，无法避免光谱重叠带来的误差且具有主观性。采用三维荧光图谱结合平行因子分析考察溶藻产物：1)数据预处理：并用Delauay三角形内插值法瑞利散射及拉曼散射。2)平行因子分析：平行因子算法是基于三线性分解理论，采用交替最小二乘原理，进行迭代的三维数阵分解算法。可以将一个由多个三维荧光光谱矩阵分解为3个方向的载荷矩阵。通过对半检验法(split-half analysis)，残差平方和的最小，及核一致性检验来确定模型的有效性。采用MATLAB软件中的Nway toolbox运行[22-24]。

1.2.4 菌株的溶藻特性 为探讨溶藻细菌的溶藻机制，将培养24 h溶藻细菌R1培养液进行如下处理:

1)离心过滤上清液(8 000 r/min，10 min；过0.22 μm滤膜)、高热处理上清液(121 ℃，20 min)、菌体破碎液(取离心后的菌体沉淀超声波破碎)[16]。

2)酸碱化处置[12]：为考察pH对溶藻物质活性的影响，分别调节菌液pH为4、7、10，处置1 h后调回中性，同时做不加菌的空白对照，接菌量为10%(体积)，采用多孔细胞培养板(biologix 24孔板)进行溶藻实验，并采用显微镜计数法检查溶藻效果。

3)截留分子量[12]：为考察溶藻活性物质的分子大小，分别采用截留分子量为100、500、1 000 da的透析袋对培养24 h后的菌液进行透析1 d，取透析袋中截留液于装载铜绿微囊藻溶液的24孔板中，检查溶藻效果。

1.2.5 溶藻活性物质的纯化与分离[13]

1)菌液前处理：接种菌株R1至500 mL的LB液体培养基中，30 ℃、135 r/min，培养24 h；采用0.45 um的滤膜过滤；收集菌液并加入4倍体积的乙醇进行萃取，磁力搅拌30 min，后静置2 h；使用0.22 um的滤膜过滤；收集菌液60 ℃旋转蒸发；无菌水重溶，4 ℃保存。

2)HPLC：通过液相色谱初步确定可能性溶藻物质。色谱条件为：色谱柱wonda sil C18(4.6×250 mm)，流动相A(甲醇)∶B(1%乙酸)为1∶9，检测波长为UV200 nm。

3)为考察这几个物质是否含有溶藻活性物质，每隔一段时间收集1馏分，氮气吹干，超纯水重溶，并采用24孔板进行溶藻效果检验。对有溶藻活性的收集液，再次使用HPLC检查其纯度及其峰值。

2 结果与讨论

2.1 菌株R1的溶藻能力

将R1菌液到铜绿微囊藻溶液中(初始chl-a为205.11 mg/L)进行实验，通过肉眼观察颜色变化及chl-a含量测定检验溶藻效果，如图2。实验4 d后，肉眼可见混合液发生黄化现象，chl-a含量不断减少，10 d后剩余chl-a含量仅为35.61 mg/L，降解率达82.64%；同时观察到空白样颜色更加深绿，经测定chl-a含量，从初始205.11 mg/L增长到324.56 mg/L。

图2 溶藻细菌R1对chl-a含量的影响Fig.2 Effects of R1 on chlorophyll

2.2 三维荧光分析R1溶藻能力

取0、3、7、10、12 d的菌藻混合液进行三维荧光光谱扫描并分析，如图3。溶藻过程中藻胆蛋白荧光峰Em/Ex为650 nm/630 nm，荧光光强不断减少。为表征其溶藻效果，通过固定Em为650 nm，将得到的荧光光谱减去去离子水的荧光光谱以去除瑞利散射的影响，将瑞利散射峰置零[18]，采用oringin8.6拟合得到光强与激发波长的关系图，如图4。按照式2)计算，10 d溶藻率为达89.80%，与通过chl-a表征的溶藻率82.64%相近，可作为溶藻细菌溶藻效率的一种评价方法。

图3 菌藻液的三维荧光图Fig.3 Three-dimensional fluorescence of

图4 Em 650 nm的激发光谱及溶藻效果图Fig.4 The excitation spectra at the transmitting wavelength of 650 nm and Dissolving rate of

2.3 菌株R1溶藻机制研究

1)由表1及图5(1)看出：R1菌原液、离心上清液、高温灭菌液都发生了明显的黄化现象，溶藻效果显著；菌体破碎液及菌体没有溶藻效果；可见，其溶藻物质并不是胞内物质，也不是菌株本身，而是细菌分泌的胞外物质，具有耐高温的特性，推测为非蛋白质类物质。

2)由表2及图5(2)看出，经过不同处置的R1菌液都具有很强的溶藻效果，与空白对比，藻液均发生明显的黄化现象；显微镜计数结果见表2，从表中可见，藻细胞数量都明显减少，由此可见，溶藻活性物质性质稳定，具有耐酸耐碱性。

3)经100、500、1 000 da的透析袋截留分子量后袋中截留液，显微镜计数结果见表3，发现溶藻能力强弱顺序依次为100 da>500 da>1 000 da，其中，1 000 da溶藻活性很低，由此可见，细菌分泌的有效溶藻物质为小分子物质，分子量小于500 da。

表1 不同菌体处理方式对溶藻效果的影响Table 1 Effect of different gloop treatment methods on algae-lysing efficiency (cell·mL-1)

表2 不同pH处置方式对溶藻效果的影响Table 2 Effect of different pH disposal methods on algae-lysing efficiency (cell·mL-1)

表3 不同截留分子量对溶藻效果影响Table 3 Effect of different molecular weight on algae-lysing efficiency (cell·mL-1)

图5 R1菌液经不同处理对溶藻的效果影响Fig.5 The algae-lysing efficiency of R1 bacteria solution

2.4 三维荧光图谱结合平行因子模型分析R1溶藻产物

菌株R1溶藻过程中,Em/Ex为400～600 nm/250～450 nm处出现了大面积的荧光反应，荧光光谱不成规则的圆形，成分复杂，如图3。分别对铜绿微囊藻分泌物、菌液及其降解后的菌藻共培液液进行三维荧光光谱扫描，三维矩阵图谱见图6，分别为藻细胞产生的溶解性代谢性产物(EOM)(Em/Ex 335 nm/280 nm)、R1菌液的主要溶解性荧光组分(Em/Ex 335 nm/280 nm、Em/Ex 435～475 nm/350～380 nm、Em/Ex 475 nm/280 nm)及溶藻产物组分(Em/Ex 335 nm/280 nm、 Em/Ex 335 nm/230 nm)。

图6 菌藻混合液的三维荧光光谱EMMsFig.6 Three-dimensional fluorescence spectra of algal

运用PARAFAC模型结合EMMs图谱对溶藻产物的三维荧光矩阵进行解析，并通过残差和最小分析法及裂半分析法，识别出溶藻混合液共含有可分为2个类型。分别为：475 nm/250～350 nm；330 nm/220～270 nm，对应及类色氨酸类物质[22-24]。这2个成分的荧光图谱及激发发射波长载荷见图7。从图中可见，2个荧光成分的激发载荷图谱具有2个激发峰和1个发射峰，主要体现了长波类腐殖质及色氨酸物，分析其溶藻过程中，长波类类色氨酸类物质增加，为主要溶藻产物。根据其成分可推测出，藻细胞死亡后，胞内的物质及细胞组分大量释放到混合液中。长波类类腐殖酸减少，根据其化学形成原理(由-COOH、-OH基团的有机化合物合成的结果)，其中可能含有迫使藻死亡的有效成分，结合其分子量及极性特征猜测可能为小分子的疏水性氨基酸(hydrophbic acid)。

图7 PARAPC分析溶藻组分及其激发发射波长载荷Fig.7 Fluorescence components identified by the PARAFAC model and their excitation and emission wavelengths

2.5 溶藻活性物质的分离与纯化

图8 粗提液的HPLC-200 nm扫描图Fig.8 HPLC-200 nm scan of crude

溶藻活性物质的分离难度大，目前溶藻物质的分离纯化的报道目前还很少。本研究通过采用高效液相色谱(HPLC)技术分离提纯粗提液，扫描波长200 nm的色谱图，见图8。图中具有多个物质峰，可见经前处理的菌液成分仍很复杂。每分钟收集1馏分，旋转蒸发，超纯水重溶，并采用24孔板进行溶藻效果检验。其中有1馏分具有溶藻效果，见如9，其在既定条件下有个主要峰，保留时间分别为6.005。结合荧光光谱分析，结合荧光光谱分析，其属于某种疏水性酸类。由于HPLC分离效率低，分离量极少而且成本很高，分离的馏分中仍还有其他成分，其溶藻物质仍需进一步分离及鉴定。

图9 溶藻活性物的HPLC-200 nm扫描图Fig.9 The HPLC-200 nm scan of the lytic active

3 结论

1)从太湖土著激荡鱼内脏中筛选的R1菌(Lysinibacillusmacroides)，以铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)为受试对象，10 d内chl-a含量从205.11 mg/L降至35.61 mg/L，溶藻率达82.64%。高温处置、酸碱处置、透析处置手段确定R1菌通过分泌耐高温的非蛋白类物质溶藻，属于间接溶藻，且该物质具有耐酸耐碱性，其分子量小于500 da。

2)荧光光谱能够很好的表征铜绿微囊藻含量的变化，其荧光物质为藻胆蛋白。溶藻过程中其强度不断减少，可见藻细胞不断被破坏，数量被不断减少。固定Em为650 nm，通过荧光激发光谱图对藻细胞密度进行定量分析。通过荧光光强表征溶藻效果，避免了传统藻类测量过程的繁琐，具有重要意义。荧光光谱分析表明溶藻活性物质可能为疏水性酸。溶藻过程中，长波类类色氨酸类物质增加，为主要溶藻产物。根据其成分可推测出，藻细胞死亡后，胞内的物质及细胞组分大量释放到混合液中。长波类类腐殖酸减少，根据其成分(含有-COOH、-OH基团的有机化合物)猜测，其中可能含有迫使藻死亡的有效成分，可能为某种疏水性氨基酸(hydrophbic acid)。

3)采用高效液相色谱(HPLC)技术分离提纯粗提液(扫描波长200 nm)，分离结果表明，从R1粗提液中分离出的1馏分溶藻活性物质，其在既定条件下其出峰时间为6～8 min左右，推测其为某种酸类物质，但这需要进一步的分离和鉴定。