李楠静，黄 娟，张 又，何 菲

(1．成都中医药大学临床医学院，成都 610072；2.四川省人民医院血液科，成都 610072； 3．四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室，成都610041)

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，在我国发病率和病死率较高。目前除了化疗等传统治疗手段以外，也在探索中西医结合的肿瘤综合治疗方案。华蟾素是从传统中药材蟾皮中提取的生物制剂，具有清热解毒、消肿化瘀等功效，多项研究发现其具有较强的抗肿瘤作用[1-2]。Rho GTPases是重要的细胞内信号分子，参与调控许多细胞生理进程，Rho家族在肿瘤细胞中通常呈高表达，几乎参与了肿瘤发生、发展的每一个重要环节，RhoA、Cdc42和Rac1是其中最受关注的分子[3-4]。本实验通过华蟾素对胃癌SGC7901细胞增殖能力和细胞内Rho GTPases(RhoA、Cdc42、Rac1)表达的影响，为胃癌的综合治疗提供新的理论依据和选择方向。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 胃癌细胞系SGC7901(四川大学信号转导及分子靶向治疗实验室提供)；华蟾素(每支5 mL，安徽华润金蟾药业股份有限公司)；鼠抗人RhoA、Cdc42、Rac1、β-actin单克隆抗体(美国BD公司)；RPMI1640培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)；lipofectamineTM2000、Trizol(美国Invitrogen公司)；RT-PCR试剂盒(日本Takara公司)；CCK-8试剂盒(日本Dojindo公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养 胃癌细胞系SGC7901由RPMI 1640 (含10%胎牛血清)， 37 ℃、5%CO2敷箱常规培养。

1.2.2CCK-8法检测细胞增殖抑制率 培养胃癌细胞系SGC7901细胞至对数生长期，按照每孔2×103密度接种于96孔板,培养24 h细胞贴壁后加入华蟾素，使其最终浓度达到0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL，每个实验组设3个复孔,并设对照组。分别于药物培养24、48、72 h进行检测。检测时更换为100 μL新鲜培养液与10 μL CCK-8试剂混合继续孵育4 h，用酶标仪读取吸光度(A)值,选择490 nm和630 nm双波长,增殖抑制率(%)=(1-实验组A值/对照组A值)×100%。

1.2.3Western blot检测RhoA、Cdc42、Rac1蛋白的表达 收集3种浓度(0.5、1.0、2.0 mg/mL)华蟾素培养48 h后的SGC7901细胞，制备细胞总蛋白，BCA方法进行蛋白质定量。取等量的蛋白样品行12%聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳,并将蛋白转移至PVDF膜，5%的脱脂奶粉封闭2 h，加入RhoA、Cdc42、Rac1抗体4 ℃摇床孵育过夜,加入荧光二抗避光于室温振摇2 h，将膜直接置于红外荧光扫描仪中扫描，与内参照β-actin进行比较。

1.2.4RT-PCR检测RhoA、Cdc42、Rac1 mRNA的表达 收集3种浓度(0.5、1.0、2.0 mg/mL)华蟾素培养48 h后的SGC7901细胞，以Trizol试剂提取总RNA，按照PCR试剂盒说明书方法反转录获得cDNA。按表1引物进行RT-PCR扩增，PCR反应条件为95 ℃预变性5 min,94 ℃变性30 s,57 ℃退火45 s,72 ℃延伸30 s，共36个循环，最后1个循环72 ℃延伸5 min,利用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，凝胶图象分析仪进行条带分析。

表1 RT-PCR所用引物序列

2 结 果

2.1华蟾素对SGC7901细胞增殖活性的影响 随着华蟾素浓度的增加和作用时间的延长，其对SGC7901细胞增殖抑制作用也在逐渐增强，呈剂量及时间效应关系，各浓度华蟾素组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 华蟾素对SGC7901细胞增殖的影响

a：P<0.05,与对照组比较

2.2华蟾素对SGC7901细胞RhoA、Cdc42、Rac1蛋白表达的影响 随着药物浓度的增加，RhoA、Cdc42、Rac1蛋白表达水平逐渐降低，呈现剂量依赖性，当剂量达到2.0 mg/mL的时候蛋白表达量最低，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

图1 Western blot检测各组SGC7901细胞中RhoA、Cdc42、Rac1蛋白表达

2.3华蟾素对SGC7901细胞RhoA、Cdc42、Rac1 mRNA表达的影响 随着药物浓度的增加，RhoA、Cdc42、Rac1 mRNA表达量逐渐降低，显示出剂量依赖性，各浓度华蟾素组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 华蟾素对SGC7901细胞中RhoA、Cdc42、Rac1 mRNA表达的影响

a：P<0.05,与对照组比较

3 讨 论

胃癌是最常见的恶性肿瘤，是世界上第2大癌症死因。我国是胃癌高发区，其发病率和病死率高居各种恶性肿瘤之首，严重威胁着人们的健康和生命，胃癌目前临床上主要采用以5-FU为基础的化疗方案[5]，然而胃癌5年相对生存期仍然很低，探索新的有效抗肿瘤成分的药物和对相关的信号转导通路的影响成为近年来肿瘤研究的重点。华蟾素是以中华大蟾蜍皮为主要原料制成的一种水溶性制剂,具有清热解毒，消肿化瘀等作用。研究发现华蟾素对肝癌、胰腺癌、结肠癌、骨肉瘤、乳腺癌等多种肿瘤细胞的生长和增殖有较强的抑制作用，能够诱导肿瘤细胞的分化和促进凋亡，逆转多药耐药性[6-9]。

Rho GTPases家族均有与GTP结合的基因序列，与GDP和GTP有很高的亲和力，能够接收多种刺激信号。Rho家族是细胞内重要的信号分子，可以参与调控细胞骨架重组、细胞黏附和移动、细胞周期、细胞凋亡、细胞分裂、基因转录等多种生理过程[10]。作为Rho家族研究最多最具代表性的3个分子，大量的基础实验研究发现RhoA、Cdc42、Rac1与肿瘤的发生、发展有重要的联系，可以促进细胞分裂，加速细胞的生长、增殖；促进肿瘤血管壁的发育，加速肿瘤血管的生成；能够对抗和阻断细胞的凋亡信号转导途径从而抑制细胞的凋亡[11-13]。目前多个研究发现RhoA、Cdc42、Rac1在胃癌细胞和组织中呈现高表达[14-15]，本实验希望通过研究不同浓度华蟾素对胃癌细胞中RhoA、Cdc42、Rac1基因表达的影响，探讨华蟾素通过Rho GTPases信号通路抗胃癌的作用机制。

本实验首先采用CCK-8法检测4种(0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL)不同浓度华蟾素作用于SGC7901细胞24、48、72 h后的增殖活性，显示各实验组与对照组相比增殖活性受到明显抑制，0.5 mg/mL浓度的华蟾素对SGC7901细胞即有抑制作用，2.0 mg/mL浓度的华蟾素在72 h时抑制率为最高，增殖抑制率呈现出剂量和时间依赖性关系。细胞增殖抑制实验得到的有效浓度范围中，选择3种(0.5、1.0、2.0 mg/mL)不同浓度华蟾素，用Western blot和RT-PCR分别检测其作用于SGC7901细胞48 h后RhoA、Cdc42、Rac1蛋白和基因表达，显示RhoA、Cdc42、Rac1蛋白和mRNA表达水平均较对照组降低，且随着华蟾素浓度的增加，3种分子的蛋白和mRNA表达量逐渐降低，2.0 mg/mL浓度的华蟾素抑制蛋白和mRNA表达作用最强，呈现剂量依赖性。表明华蟾素可以降低胃癌SGC7901细胞中Rho GTPase的表达，通过抑制Rho家族信号转导通路中相关分子的表达来降低细胞的增殖能力，从而起到抗肿瘤的作用。本实验为华蟾素抗胃癌的作用机制提供新的研究方向，为其临床应用提供理论依据。