李 杨，张 季，杨思原，谢 琳

(云南省肿瘤医院/昆明医科大学第三附属医院:1.肿瘤内科;2.乳腺科，昆明 650118)

乳腺癌(BC)每年约有130多万新发病例和45万死亡病例[1]，是导致女性死亡的主要原因。根据癌细胞是否表达雌激素受体(ERα)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体-2(HER2)，可将乳腺癌分为ERα+，HER2+和三阴性乳腺癌(TNBC)3种类型[2]。虽然乳腺癌的发病尚无明确观点，但国内外大量研究标明微小RNA(microRNA)参与调控多种恶性肿瘤的发生、发展，microRNA在核糖核酸(RNA)沉默和调控基因表达的转录后翻译等过程中发挥重要作用[3-4]。2016年研究发现，miR-148a-3p可抑制膀胱癌等多种恶性癌细胞的增殖[5]，miR-148a-3p在乳腺癌是否也存在类似作用。本研究旨在探讨miR-148a-3p对乳腺癌细胞增殖的影响及在乳腺癌中发挥作用的可能的机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料 乳腺癌MCF-7细胞株和MCF-10A细胞株，雌激素受体阳性，购自中科院上海细胞生物学研究所细胞库。

1.2主要仪器与试剂 凝胶电泳仪、垂直电泳槽及凝胶成像系统(Bio-rad，美国)，实时荧光定量PCR仪ABI 7300(Applied Biosystems，美国)，青霉素-链霉素混合溶液(Sigma，美国)，miR-148a-3p模拟物和对照载体(上海吉码生物科技有限公司)，pGL3荧光素酶检测系统(Promega，美国)，DEPC水(碧云天生物生物科技公司)，荧光定量试剂盒One Step SYBR®PrimeScriptTMRT-PCR Kit(大连宝生物有限公司)，PCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、兔抗神经母细胞瘤病毒性ras致癌因子的同原体(NRAS)及辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠二抗(Abcam，美国)，四甲基偶氮唑盐(MTT)、AnnexinV-FITC/碘化丙啶(AnnexinV-FITC/PI)凋亡试剂盒、SDS/PAGE电泳凝胶混合液及ECL显色试剂(碧云天生物生物科技公司)。微量紫外可见光分光光度计、恒温培养箱、超净工作台、改良Eagle培养基(DMEM)、胎牛血清(FBS)、Opti-MEM培养基、Lipofectamine®3000、质粒提取试剂盒、Trizol试剂和蛋白Maker(Thermo，美国)。

1.3方法

1.3.1细胞培养及转染 人乳腺癌细胞株-7(MCF-7)细胞株用10% FBS和90%DMEM培养液培养，加入1% 青霉素-链霉素，置于37 ℃，5% CO2的培养箱，培养过夜。将MCF-7细胞接种于6孔板内，1×105个/孔，待细胞汇合率达到约80%，用Lipofectamine®3000转染试剂将miR-148a-3p的模拟物和miR-148a-3p进行转染，待转染48 h，备用。MCF-7细胞未经转染处理为未转染组，根据MCF-7细胞是否转染及是否存在miR-148a-3p分为3个组：未转染组、miR-148a-3p对照组和miR-148a-3p转染组。

1.3.2四唑盐比色法(MTT)细胞增殖实验 将3个组细胞接种于6孔板内，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT，放回细胞培养箱内继续培养。4 h后，根据450 nm酶标仪比色测定的每孔的吸光度值(A)来分析细胞增殖情况。

1.3.3提取总RNA 将3组细胞收集细胞至EP管并加入1 mL Trizol试剂和0.2 mL氯仿，用力震荡后室温静置3 min，在4 ℃低温离心机12 000 r/min 离心15 min。吸取上层水相，转至新的EP管，加0.5 mL异丙醇，室温静置20 min，在4 ℃低温离心机12 000 r/min离心15 min。弃上清液，得到白色沉淀，即核糖核酸(RNA)。用75%乙醇洗涤RNA 2次，室温晾干，用焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解。紫外分光光度计测定RNA溶液的纯度，即A260 nm/A280 nm的比值，为1.8～2.1。

1.3.4实时荧光定量PCR(RT-qPCR)实验 反转录用 TaKaRa PrimeScript 试剂盒的 SYBR GreenAssay。反应体系：5倍的PrimeScript缓冲液 2 μL，反转录酶 0.5 μL，寡核苷酸 0.5 μL，6核苷酸的随机引物 0.5 μL，把总 RNA 定量至500 ng，不含RNase的双蒸水定容终体系为 10 μL。反转录流程：将上述反转录体系在37 ℃ 水浴15 min，85 ℃水浴持续5 s。用cDNA为模板采用 7300 Real-time PCR 系统(Applied Biosystems,美国)进行RT-qPCR检测。反应体系：2 μL cDNA模板，上游引物和下游引物各0.5 μL，5 μL 2×混合缓冲液和2 μL dd水。反应条件：95 ℃ 10 min，持续40个循环：60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，溶解曲线 60～90 ℃。以公式2-ΔΔCt进行计算，ΔCt=Ct 基因-Ct内参，U6 为内参。分析3组细胞miR-148a-3p mRNA表达。

1.3.5Western blot检测 MCF-7细胞转染48 h后，收集细胞。用预冷的磷酸缓冲盐溶液(PBS)漂洗细胞3次，4 ℃ 超低温离心机1 000 r/min离心5 min，弃上清液。按沉淀质量/体积1∶5加入里帕(RIPA)蛋白裂解液，超声匀浆，12 000 r/min离心10 min，取上清液。利用二喹啉甲酸(BCA)试剂盒测定蛋白质浓度，将每组样本分别置于1.5 mL EP管中。蛋白样品中加入等体积的2倍十二烷基硫酸钠(SDS)上样缓冲液，沸水5 min使蛋白变性。进行SDS-PAGE电泳，将分离后的蛋白采用湿转法将凝胶分离后的蛋白转移到硝酸纤维素(PVDF)膜上。室温下，用5%的脱脂奶粉封闭1 h，洗涤分别加入NRAS及 GAPDH的一抗(1∶100)4 ℃摇床孵育过夜。次日用辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，室温摇床孵育1 h，TBST洗涤3次后，用化学发光法(ECL)显色液显色，GAPDH为内参，凝胶成像设备观察3组细胞miR-148a-3p蛋白表达。

1.3.6流式细胞术检测细胞凋亡 将3个组细胞用PBS洗2次，向各组细胞加入500 μL结合缓冲液重悬细胞，加5 μL Annexin V-FITC混匀，加入5 μL碘化丙啶(PI)室温避光孵育15 min，上流式细胞仪检测。

1.3.7miR-148a-3p的靶基因预测 采用生物信息学软件Targetscan预测miR-148a-3p可以结合NRAS的3′端非翻译区(UTR)。

1.3.8双荧光素酶报告基因 构建野生型和突变型NRAS-3′UTR的报告基因质粒，并将所得质粒及pRL-TK质粒，miR-148a-3p 模拟物及miR-148a-3p转染到MCF-10A细胞中，48 h之后按照双荧光素酶检测说明书检测细胞的相对荧光强度(荧光虫荧光强度/猴肾荧光强度)。

2 结 果

2.1不同组别的miR-148a-3p表达 与未转染组和miR-148a-3p对照组相比，miR-148a-3p转染组的miR-148a-3pmRNA显著升高 (P<0.05) ，见图1。

*:P<0.05，与未转染组和miR-148a-3p对照组比较

图1不同组别的miR-148a-3p表达

2.2不同组别的细胞增殖的情况 与未转染组和miR-148a-3p对照组相比，miR-148a-3p转染组的MCF-7细胞的增殖能力最低 (P<0.05)，见图2。

*:P<0.05，与未转染组和miR-148a-3p对照组比较

图2不同组别的细胞增殖率

A：Western blot；B：NRAS表达；*:P<0.05，与未转染组和miR-148a-3p对照组比较

图3不同组别的NRAS蛋白表达

2.3miR-148a-3p与NRAS-3′UTR的关系 NRAS-3′UTR序列与miR-148a-3p序列间存在特定结合区域，NRAS可能是miR-148a-3p的靶点。

2.4不同组别的NRAS表达 与未转染组和miR-148a-3p对照组相比，miR-148a-3p转染组的NRAS的mRNA和蛋白水平均明显降低(P<0.05)，见图3、4。

*:P<0.05，与未转染组和miR-148a-3p对照组比较

图4不同组别的NRASmRNA表达

2.5不同组别的凋亡情况 与未转染组和miR-148a-3p对照组相比，miR-148a-3p转染组的凋亡明显(P<0.05)，见图5。

图5 不同组别的凋亡情况

2.6miR-148a-3p与NRAS-3′UTR的关系miR-148a-3p显著抑制野生型NRAS-3′UTR质粒转染的细胞的荧光素酶活性(P<0.05)，对突变型NRAS-3′UTR质粒转染细胞的荧光素酶活性并无明显的影响(P>0.05)，见图6。

*:P<0.05

图6 miR-148a-3p与NRAS-3′UTR的关系

3 讨 论

microRNA是一类广泛存在于植物，动物甚至病毒体内的包含约22个核苷酸的小的非编码RNA，在RNA沉默和调控基因表达的转录后翻译等过程中发挥作用[3-4]。miRNA在细胞的生长和分化及信息传递等过程中均扮演重要的角色。近年来研究表明miRNA在肿瘤的发生和发展过程中发挥促癌或抑癌的作用,影响进而肿瘤的增殖、凋亡、侵袭和转移等行为学[6]。miR-148a-3p位于7p15.2染色体区域，是已知的肿瘤抑制因子[7]。近年研究显示miR-148a-3p在多种恶性肿瘤发挥重要作用：(1) miR-148a-3p可以通过抑制BMP信号通路抑制胃癌细胞系的侵袭和转移[8]；(2)miR-148a-3p通过调节ERBB3/AKT2/c-myc 和 ERBB3/AKT2/Snail 等信号通路抑制膀胱癌细胞增殖[5]；(3)miR-148-3p在喉鳞状细胞癌中严重减少，通过DNMT1调节RUNX3的表达抑制细胞增殖[9]。与之前的研究类似，本研究结果显示，在乳腺癌MCF-7细胞中瞬时过表达miR-148a-3p可以显著抑制细胞的增殖，并促进细胞凋亡，但乳腺癌MCF-7细胞中miR-148a-3p的作用通过何种下游分子实现还未见相关报道。本研究发现在MCF-7细胞中瞬时过表达miR-148a-3p后，与未转染组和miR-148a-3p对照组相比，miR-148a-3p 转染组NRAS的mRNA及蛋白水平明显下降，双荧光素酶报告基因实验证实，miR-148a-3p直接靶向NRAS-3′UTR。NRAS是NRAS基因编码的一种酶，由Robin Weiss等首次在神经母细胞瘤中发现[10-11]。人类的ras基因共分为HRAS，KRAS和NRAS等3种基因，他们拥有结合GTP/GDP及GTPase的能力，正常生理状态下控制细胞的正常生长。12、13或61位氨基酸残基的突变可以激活N-ras的潜能，并促进肿瘤的恶化，例如黑色素瘤[12]；另外，在伊朗人群中，结直肠癌患者体内发现有NRAS基因的突变[13]；NRAS siRNA可以显著抑制肺癌细胞的活性[14]。现研究明确的NRAS信号通路的下游有2种，即MAPK 信号通路和 PI3K/AKT/mTOR 信号通路[15-16]。本研究的结果与之前关于NRAS在肿瘤中作用的报道一致。本课题也存在以下两方面的问题：(1)研究指出与耐药胃癌细胞系相比，非耐药胃癌细胞系的miR-148a-3p表达相对较高，本课题未进行耐药MCF-7细胞的研究，探讨miR-148a-3p的作用仍较单薄[11]；(2)miR-148a-3p靶向NRAS-3′UTR抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖过程所涉及的具体的分子，未做研究，具体将在未来工作中开展并探讨。综上所述，本课题结果显示乳腺癌MCF-7细胞中，miR-148a-3p通过靶向NRAS-3′UTR调控细胞的增殖与凋亡，提示miR-148a-3p可以作为治疗乳腺癌新的靶点，miR-148a-3p高表达可能与乳腺癌良好预后相关。