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(1. 山东农业大学资源与环境学院， 土肥资源高效利用国家工程实验室， 山东 泰安271018；2. 山东省畜牧总站， 山东 济南250022)

土地盐碱化已经对全球农业生产造成了严重的影响，而不合理的开发利用和生态环境的不断恶化使盐碱地面积进一步扩大[1-2]。目前，全球盐碱地面积约为10亿hm2，约占全球陆地面积的6.7%，已成为仅次于干旱的农业生产第二大非生物胁迫因素[3]。中国盐碱地总面积约为0.99亿hm2，约占国土面积的1/3，主要分布在东北、华北、西北内陆地区以及长江以北沿海地带[1,4]。

苜蓿(MedicagoL.)有“牧草之王”的美誉，具有高产、优质、抗逆性强、适口性好等特点，其在牧草生产中的作用和地位不断提升[5]。世界各国广泛引种苜蓿，育成了大量苜蓿种质材料[6-7]。盐害是限制苜蓿广泛种植的重要因素之一[6,8]。苜蓿在中轻度盐碱土壤中生长良好，若能进一步提高其耐盐性，使其适应盐碱度更高的土壤，将会大大扩展苜蓿的适宜种植范围，有利于提高盐碱地利用效率。国内外学者对于苜蓿耐盐碱性的生理生化机制[9-10]、耐盐种质筛选、优良品种选育等方面做了大量工作[11-13]。但已有的研究在时期选择上主要集中于苗期，而萌发期耐盐筛选研究较少，有待在已有研究的基础上，总结一种苜蓿萌发期耐盐综合评价体系。萌发是作物生长的第一个阶段，种子能否萌发是其在盐碱地推广利用的一个重要前提因素。本研究采用加权隶属函数法，采用多个鉴定指标并进行加权计算，对120个苜蓿种质材料进行萌发期耐盐性评价，以探明苜蓿萌发期的耐盐性综合性评价方法，同时筛选萌发期耐盐性较强的优良种质资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试苜蓿种质材料为120个品种(含115个紫花苜蓿，5个杂花苜蓿)，其中107个由国家植物种质资源共享平台提供，7个商业种购自北京克劳沃种业，6个材料由新疆农科院惠赠。来源和编号详见表1。

表1 供试苜蓿种质材料地理来源及编号Table 1 Geographical origin and code of tested varieties of alfalfa

1.2 耐盐性鉴定

利用智能型光照培养箱进行种子萌发试验，采用纸上发芽法。设蒸馏水(对照)和盐胁迫(150 mmol·L-1NaCl溶液)2种处理，3次重复，每个重复50粒。试验前先将种子用10%的过氧化氢(H2O2)灭菌5分钟，用蒸馏水冲洗干净后将种子均匀地摆放在发芽盒中，盐胁迫和对照组分别加入盐溶液和蒸馏水各15 mL。培养条件为白天16 h，25℃；晚上8 h，20℃。

发芽标准为胚根与种子等长，苗高为种子长的1/2。培养的第4天开始，隔天统计发芽数，计算发芽势(germination potential，GP)、发芽率(germination rate，GR)和萌发指数(germination index，GI)；培养的第10天每盒分别随机挑取10株幼苗，分别测量根长(root length，RL)，即根尖到子叶着生点的长度；苗高(shoot height，SH)，即从子叶着生点到叶尖的长度。然后把根和苗分开，称量根鲜重(root fresh weight，RFW)和苗鲜重(shoot fresh weight，SFW)后，分别放入纸袋里，105℃杀青1小时，75℃继续烘干至衡重，称量根干重(root dry weight，RDW)和苗干重(shoot dry weight，SDW)。计算鲜重根冠比(root-shoot ratio of fresh weight，R/S-FW)和干重根冠比(root-shoot ratio of dry weight，R/S-DW)。

发芽势(%)=(培养第4天发芽数/ 50)×100。

发芽率(%)=(培养第10天发芽数/ 50)×100。

耐盐系数=盐胁迫指标平均值/对照指标平均值。

萌发指数=(1.00)nd4+(0.75)nd6+(0.50)nd8+(0.25)nd10(式中：nd4、nd6、nd8、nd10分别为第4、6、8、10 d的种子发芽率；1.00、0.75、0.50、0.25分别为相应萌发天数所赋予的系数[14]。

各指标的耐盐系数以其英文缩写前加R(relative)表示，如以RGP(relative germination potential，RGP)表示发芽势耐盐系数。

1.3 耐盐性综合评价

以供试材料的各耐盐相对指标为依据，计算加权隶属函数，并根据加权隶属函数值(D值)进行聚类分析[15]。公式如下：

μ(Xi)=(Xi-Xi min)/(Xi max-Xi min)

式中，Xi为各供试材料基于鉴定指标i的耐盐系数，Ximax、Ximin分别为供试材料中Xi的最大值和最小值，μ(Xi)为各供试材料Xi的隶属函数值，CVi为各供试材料μ(Xi)的变异系数，Wi表示CVi在总变异中所占比率。

1.4 数据分析

利用Excel 2007整理试验数据，使用SPSS Statistics 17.0进行多元统计分析，用Pearson法进行相关性分析[16]，K-均值聚类法进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 NaCl胁迫对苜蓿种子萌发和幼苗生长的影响

参试苜蓿种质材料萌发期鉴定指标的方差分析显示，除苗鲜重和苗干重外，其余11项鉴定指标在不同种质间和不同处理下均存在极显著的差异(表2)，说明150 mmol·L-1NaCl溶液能够有效地区分不同种质材料的耐盐性。

表2 苜蓿种质材料萌发期性状的方差分析(F检验值)Table 2 Variance analysis of germination traits in alfalfa varieties (F-test value)

注：*表示在0.05水平上显著相关；**表示在0.01水平上显著相关，下同

Note:*indicates significant correlation at the 0.05 level;**indicates significant correlation at the 0.01 level, the same as below

由表3可知，与正常条件相比，13项鉴定指标在150 mmol·L-1NaCl溶液下的平均值均呈不同程度的下降，其中下降最大的为发芽势(64.4%)，其次为萌发指数(54.4%)与发芽率(46.2%)，下降最小的为苗鲜重(1.5%)，其次为苗干重(2.4%)和总干重(9.3%)。说明150 mmol·L-1浓度的NaCl溶液对苜蓿种子的萌发和幼苗的生长均有一定的抑制作用。从鲜重指标看，对照(蒸馏水)中的根鲜重和苗鲜重分别为60.20 mg、162.05 mg，盐胁迫下的根鲜重和苗鲜重分别为41.22 mg、159.69 mg，盐胁迫对根鲜重和苗鲜重的抑制率分别为31.53%和1.15%，说明盐胁迫对根的抑制大于苗。从参试材料看，所有材料的发芽势和萌发指数均受到抑制；发芽率除‘新牧2号’的发芽率略有下降，‘绿苜1号’的发芽率持平，其余所有材料的发芽率都呈减小趋势；‘榆次’、‘河西’等14个种质的根长呈上升趋势，其余呈下降趋势；‘蔚县’、‘肇东’等4个种质的苗高

呈上升趋势，其余呈下降趋势。根鲜重、根干重、苗鲜重、苗干重、鲜重根冠比、干重根冠比、总鲜重和总干重分别有98，104，58，60,102，113，91和87个材料呈下降趋势。说明不同种质间受盐胁迫抑制程度存在差异。

表3 苜蓿种质材料在盐胁迫和正常条件下的种子萌发和幼苗生长情况Table 3 Seed germination and seedling growth of alfalfa varieties under salt stress and distilled water

2.2 苜蓿种质材料据单项指标的耐盐差异

不同苜蓿种质材料在基于13个鉴定指标的耐盐系数上都有不同的表现，其变异系数最大为58.74%(RGP)，最小为23.15%(RTFW)。在分别以13项单个鉴定指标为依据的种质耐盐性排序不一致，如‘矩苜蓿’在干重根冠比指标中耐盐性最好，但是在苗干重指标中的耐盐性却最差(表4)。因此，依据任一单项耐盐系数都不能全面、有效地评价不同苜蓿材料的耐盐性，综合考察这些指标的评价是必要的。

表4 基于不同鉴定指标的耐盐系数Table 4 Coefficient of salt tolerance based on different identification indices

2.3 各指标耐盐系数的隶属函数值与D值间的相关性分析

以各指标的相对耐盐系数为依据，利用加权隶属函数法得到了120个苜蓿种质各指标耐盐系数的隶属函数值(表5)。就平均值而言，μ(RTDW)最大，μ(RSH)最小；通过变异系数的比较表明，μ(RSDW)和μ(RTDW)在种质间的差异最小，μ(RR/S-FW)在种质间的差异最大；在权重方面，μ(RGP)和μ(RR/S-FW)的权重最大，μ(RSDW)与μ(RTDW)的权重最小。

表5 苜蓿种质基于13种耐盐系数的隶属函数值Table 5 Membership function values of alfalfavarieties based on thirteen kinds of salt tolerant coefficient

供试120个苜蓿种质的D值变化范围为0.1510～0.7212。相关性分析表明，D值与全部指标隶属函数均呈极显著正相关关系；萌发性状间(RGP、RGR、RGI)全部呈极显著正相关；萌发性状与苗期性状间也多呈极显著正相关(表6)。说明D值可以综合评价苜蓿萌发期耐盐性，并且D值越大对应材料的耐盐性越强。μ(RGP)、μ(RGR)、μ(RGI)、μ(RRFW) 4项指标与D值都呈极显著正相关，且相关系数较大(0.783，0.786，0.824，0.819)，说明发芽势、发芽率、萌发指数、根鲜重与萌发期耐盐性的关系最为密切，其中萌发指数隶属函数值与D值相关性最大(0.824)。

表6 基于各指标的耐盐系数的隶属函数值与D值的相关性分析Table 6 Correlation analysis of the D value with membership function values based on salt tolerant coefficient of identification indices

2.4 苜蓿萌发期耐盐性的综合评价

根据供试苜蓿种质材料的D值，采用K-均值聚类法对供试苜蓿种质进行聚类分析，120个苜蓿种质材料可被分为5个类群，依据D值大小分别归为5个耐盐性级别(表7)。首领等11个材料(9.2%)为高耐盐级(1级)，巨能801等24个材料(20.0%)为耐盐级(2级)，固原等38个材料(31.6%)为中等级(3级)，莎车等36个材料(30.0%)为敏盐级(4级)，伊犁等11个材料(9.2%)对高敏盐级(5级)。以上分级符合正态分布，因而这种分级是合理的。总体来看，属于耐盐性1级和2级的35个材料都具有较大的耐盐系数(0.5以上)。

表7 基于D值对120个苜蓿种质耐盐性的分级结果Table 7 Classification of salt tolerance of 120 alfalfa varieties based on the D value

3 讨论

3.1 关于NaCl胁迫对苜蓿种子萌发和幼苗生长的影响

在盐浓度选择上，本研究选用150 mmol·L-1NaCl溶液进行耐盐筛选。韩清芳等[17]用0.3%、0.7%、1.0%质量浓度的NaCl溶液分别对19个苜蓿种质进行处理，结果表明用0.7%、1.0%的NaCl溶液进行苜蓿种子萌发期耐盐性鉴定较为合理。这与我们选择的浓度(150 mmol·L-1约与0.87%质量浓度相当)水平相近，此浓度达到重度盐碱水平。本试验中盐溶液对苜蓿的萌发和幼苗的生长均有一定的抑制作用，盐胁迫对根的抑制大于苗，这一研究结果与已有的研究结果一致[18-19]。与其他作物比较，我们的研究结果与水飞蓟对盐胁迫的反应相似[20]，但与扁蓿豆对盐胁迫的研究结果不同，扁蓿豆幼苗在盐胁迫下芽长比根长下降更多[21]。这可能是因作物不同，对盐害的敏感时期也不同，因此要根据具体作物来确定合适的鉴定指标。关于萌发期和幼苗期耐盐是否相关，于洁等[22]研究表明，苜蓿种子萌发和幼苗生长之间存在显著相关性。本研究表明，萌发性状与苗期性状间多呈极显著正相关，说明苜蓿萌发期的耐盐性至少与幼苗早期的耐盐性是高度相关的，但是否影响幼苗后期的相关耐盐性能需待进一步研究。

3.2 萌发期耐盐性的综合评价

前人对苜蓿耐盐性进行评价方法各异。常俊等[23]根据相对出苗率及盐浓度之间的相关性进行耐盐性评价。李源等[24]利用标准差系数赋予权重法对紫花苜蓿种质耐盐性进行综合评价。而采用隶属函数值法可以确定各鉴定指标的变异系数及权重，直观表明各项鉴定指标耐盐性所占比率，全面、准确地评价种质的耐盐性[25]。本研究中，依据每个鉴定指标对种质耐盐的排序各异，这印证了选用多个鉴定指标的必要性。本研究发现，萌发指数耐盐系数与D值呈极显著正相关，说明萌发指数耐盐系数在耐盐性鉴定指标中具有重要作用，建议在苜蓿耐盐种质筛选时，将萌发指数作为一个简单而有效的指标[26]。

3.3 萌发期耐盐种质筛选

以往对苜蓿种质的耐盐性所做的研究，受所选材料限制，其筛选结果不一[6,8-10]。本研究对120个中外苜蓿种质材料进行综合评价，根据D值将其分为高耐盐、耐盐、中等、敏盐和高敏盐5个类群。首领等11个苜蓿种质属于高耐盐类群，巨能801等24个苜蓿种质属于耐盐类群。建议将这些苜蓿种质在进一步田间筛选后作为耐盐材料在盐碱地推广利用。同时这些材料也可以作为苜蓿耐盐育种的重要亲本材料。在高耐盐和耐盐等级的35个材料中，无棣苜蓿、WL324、中苜3号等种质在黄河三角洲等盐碱地种植广泛，这些种质耐盐碱能力并不是最高的(2级)，原因可能是生产中要考虑耐盐能力和高产、优质等性状的相互协调。

4 结论

150 mmol·L-1的盐溶液对苜蓿的种子萌发和幼苗生长均有一定的抑制作用，种子萌发比幼苗生长受抑制程度更大；盐胁迫对根的抑制大于苗。

不同苜蓿品种的耐盐性差异显著，通过加权隶属函数法可以综合评价苜蓿萌发期耐盐性，根据加权隶属函数值和聚类分析，可将120个种质分为耐盐性不同的5个级别，其中‘首领’、‘山雀’、‘新牧2号’、‘劳博’等11个品种的耐盐性能最佳。