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(中国农业大学动物科技学院草业科学系 草业科学北京重点实验室, 北京 100193)

人工施用化学氮肥和生物固氮是农业生产中植物获得氮素的两种有效途径。化学氮肥的成本高、使用效率低，同时会污染水源和侵蚀土地，不利于环境的可持续发展。生物固氮将氮气转化为被植物吸收利用的氮素同时具有不污染环境，利用率高等优点。根瘤菌能诱导豆科植物根、茎上的皮层细胞增生形成瘤状结节并在瘤中大量形成共生固氮的类菌体，供植物合成蛋白质[1]。在环境问题日益严峻的大背景下，苜蓿根系发达且对地面覆盖度大，能够有效防止雨水冲刷、减少水土流失，而且与根瘤菌共生固氮作用下能够逐步提高土壤肥力和养分含量、改良土壤理化性，在我国生态建设中发挥着重要的作用[2]。但根瘤固氮存在菌体与植物特异性识别，此外还受多种因素的影响(如土壤条件)，因此在使用前要进行筛选，才能保证根瘤菌有效的起到固氮作用。

优质紫花苜蓿的干草蛋白质含量可达18%，粗蛋白消化率是70%，是可消化蛋白质最高的牧草之一[3]。2012年农业部和财政部共同启动实施“振兴奶业苜蓿发展行动”，在政策带动和市场拉动下，优质植物性蛋白饲料的需求量大，苜蓿已成为不可替代的战略性饲草[4-5]。但是目前国内苜蓿的产量和品质远远不能满足市场的需要，如何提高苜蓿的品质和产量是我国目前发展紫花苜蓿产业迫切需要解决的问题。使用高效的根瘤菌接种是提高苜蓿生产力的最重要方法之一。根瘤菌筛选时不仅要考虑寄主植物的因素，还要考虑土壤环境的影响[6]。师尚礼等[7]以两种苜蓿为材料在甘肃省5个生态区调查结果表明，在黑垆土生态区苜蓿根瘤菌的有效性最好，灰钙土和灌淤土地区为其次，最差的是亚高山草甸土和褐土。宁国赞等[8]在内蒙古等23个省区的试验结果表明：人工接种的根瘤菌相比土著根瘤菌，具有早结瘤、侵染力强等优点，苜蓿结瘤率和根瘤重量在人工接种根瘤菌后分别提高79.2%、40.7%，普遍增产效果达14%～100%。接种工程菌株相比接种野生型菌株则具有更高的固氮酶活性和总氮含量[9]。以上说明并不是所有菌株都能与豆科植物有良好的固氮效果，所以在生产实践中对苜蓿高效根瘤菌进行筛选是必要的。

本研究希望在不同土壤类型下筛选出苜蓿根瘤菌与紫花苜蓿的优良共生匹配组合，从而为苜蓿生产提供与品种匹配的优良菌株，提高苜蓿产量和品质，促进苜蓿产业发展。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1苜蓿品种 试验中使用了两个苜蓿品种，分别是‘中苜3号’(MedicagosativaL. ‘Zhongmu NO.3’)，由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所牧草研究室提供；‘龙牧806’(MedicagosativaL.×MedliloidesruthenicaSojak. ‘Longmu 806’)，由黑龙江省畜牧研究所牧草育种与栽培研究室提供。

1.1.2菌株 供试的5个根瘤菌由中国农业微生物菌种保藏管理中心(简称ACCC)提供(表1)，并以中国农业大学王涛教授实验室馈赠的苜蓿中华根瘤菌Sm1021作为参比菌株，共6个苜蓿根瘤菌株。

表1 供试根瘤菌株及其来源Table 1 Rhizobia strain and its source region

1.1.3盆栽土壤 盆栽用土壤为泥炭土和沙土，土壤理化性质由北京市农林科学院植物营养与资源研究所测定(表2)。

表2 土壤理化性质Table 2 The soil properties

1.2 试验方法

1.2.1根瘤菌活化 在无菌工作台中用移液枪将供试的6株苜蓿根瘤菌株接入灭菌的YMA液体培养基中，YMA培养基配方：胰蛋白胨10.0 g·L-1，酵母提取物1.0 g·L-1，七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)1.0 g·L-1，蔗糖5.0 g·L-1，蒸馏水1 000 mL·L-1。放置在28℃、转速为120 r·min-1的摇床中培养2～3天后，用分光光度计测定10个菌液的 OD600nm值，以较低OD600nm值菌液为标准(要求 OD600nm值大于0.5)，加入无菌水稀释，将各菌株的培养液调整至相同 OD600nm值，备用。

1.2.2种子催芽与根瘤菌接种 选择干净、饱满、色正、无坏死、无腐烂和无破损的苜蓿种子用95%乙醇浸泡5 min，无菌水反复清洗4～5次，再用洁尔灭溶液浸泡5 min，无菌水反复清洗6～8次。将消毒后的苜蓿种子播于灭菌培养皿中，置于20℃、日照时间8 h ，光照培养箱中催芽2～3天。幼根长至1～2 cm左右时，挑选长度适中、子叶完整饱满的幼苗均匀播种至18 cm×15 cm 花盆中，泥炭土每盆约1.5 kg，沙土每盆约2.5 kg，土壤均灭菌，每盆播种3穴，每穴播种1颗催芽苜蓿苗，同时在苜蓿根部加入菌液5 mL，将土压实。以不接种和Sm1021菌株作对照，重复3次。放置在温度为22～25℃，光照时间为12～14 h的温室中。随时观察，及时浇水，保持土壤湿润。

1.3 数据分析

接种75天后收获，测定各项指标(总根瘤数、植株高度、植株干重、全氮含量)。用Microsoft Excel录入数据，并作图。采用SPSS 17.0统计分析，用LSD法对各处理间的指标进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 2种盆栽土壤下‘龙牧806’苜蓿的筛选试验

2.1.1泥炭土盆栽接种结果分析 总根瘤数中，菌株ACCC17675处理下根瘤数最高为125.7个，显著高于对照CK(P<0.01)，但与Sm1021相比差异不显著，其余4个菌株与对照相比均差异不显著。株高中，供试5个菌株处理均显著高于对照CK(P<0.05)，增长范围在32.8%～90.6%之间，其中最大的是ACCC17578，株高为62.53 cm，同时菌株ACCC17578处理株高显著高于Sm1021(P<0.05)，增加了30.3%。地上部干重中，供试菌株处理与对照CK、Sm1021间无显著差异，菌株ACCC17578最大为2.734 g·株-1；各菌株处理地上部干重由高到低的顺序为：ACCC17578>ACCC17675>ACCC17512 >ACCC17551> ACCC17537。根干重中，菌株ACCC17578高于对照CK但差异不显著，但显著高于Sm1021(P<0.01)，增长了107.0%；其它各菌株处理均低于对照CK，根干重由高到低的顺序为ACCC17675>ACCC17512 > ACCC17537>ACCC17551。全氮量中，龙牧806中所有供试菌株均显著高于对照CK(P<0.05)，增长范围在32.1%～64.5%之间；菌株ACCC17578处理全氮量略高于Sm1021，其余都不同程度的低于Sm1021，见表3。

表3 ‘龙牧806’泥炭土盆栽接种根瘤菌比较Table 3 Comparison of different rhizobia strains inoculation in Longmu 806 peat potted soil

注：同列不同字母表示差异显著(P<0.05)

Note: Different letters in same column indicate significant difference at the 0.05 level. The same as below

2.1.2沙土盆栽接种结果分析 总根瘤数中，只有菌株ACCC17675处理下显著高于对照CK(P<0.05)，增加了143.8%，所有菌株处理与Sm1021相比差异均不显著。株高中，菌株ACCC17675与ACCC17578处理下高于对照CK，分别与CK相比增加13.2%和8.3%，其余菌株处理不同程度低于对照CK，但无显著差异。地上部干重中，供试5个菌株处理与对照CK间差异不显著，但是菌株ACCC17675处理显著高于Sm1021(P<0.05)，增加了68.8%，其它各菌株处理地上部干重高于对照，顺序为：ACCC17578>ACCC17551>ACCC17537>ACCC17512。根干重中，供试5个菌株处理与对照CK差异不显著，但各菌株处理均高于Sm1021。菌株ACCC17675、ACCC17578处理显著高于Sm1021(P<0.05)，分别增加了143.3%和131.7%，其它各菌株处理根干重由高到低的顺序为：ACCC17537 >ACCC17551>ACCC17512,见表4。

表4 ‘龙牧806’沙土盆栽接种根瘤菌比较Table 4 Comparison of different rhizobia strains inoculation in ‘Longmu 806’ sand potted soil

2.2 2种盆栽土壤下‘中苜3号’苜蓿的筛选试验

2.2.1泥炭土盆栽接种结果分析 ‘中苜3号’分别与5个苜蓿根瘤菌进行接种后，都有不同程度的结瘤情况。总根瘤数中，菌株ACCC17675、ACCC17551处理下根瘤数分别为78.3个和77.3个，均显著高于对照CK(P<0.05)，但与Sm1021相比差异不显著。株高中，供试5个菌株处理均显著高于对照CK(P<0.01)，增长范围在113.1%～165.8%之间，其中最大的是菌株ACCC17551处理，株高为68.13 cm，但与Sm1021相比无显著差异。地上部干重中，供试菌株除ACCC17578处理均显著高于对照CK(P<0.05)，增长幅度在147.6%～275.7%之间，其中菌株ACCC17551和ACCC17537处理下地上部干重高于Sm1021，分别为3.411 g、2.978 g，其余均不同程度低于Sm1021。根干重中，供试菌株ACCC17551处理高于对照CK但差异不显著，但显著高于Sm1021(P<0.01)，增长了84.9%，其它各菌株处理根干重由高到低的顺序为：ACCC17537>ACCC17512>ACCC17675>ACCC17578。全氮量中，所有供试菌株都显著高于对照CK(P<0.05)，增长范围在22.0%～41.3%之间，与Sm1021相比均无显著差异，见表5。

表5 中苜3号泥炭土盆栽接种根瘤菌比较Table 5 Comparison of different rhizobia strains inoculation in ‘Zhongmu No.3’ peat potted soil

2.2.2沙土盆栽接种结果分析 总根瘤数中，菌株ACCC17578处理显著高于对照CK(P<0.01)和Sm1021(P<0.05)，分别增加了163.1%和54.8%。菌株ACCC17675、ACCC17551、ACCC17512处理均显著高于对照CK(P<0.05)，分别增长了137.9%、103.4%、81.7%，与Sm1021无显著差异。株高中，供试5个菌株处理与对照CK、Sm1021间均无显著差异，菌株ACCC17512处理下最高为27.96 cm·株-1，各菌株处理株高由高到低的顺序为：ACCC17512>ACCC17537>ACCC17578>ACCC17675>ACCC17551。地上部干重中，菌株ACCC17512处理显著高于对照CK(P<0.05)，增长了48.6%，但与Sm1021无显著差异，其它各菌株处理地上部干重均高于对照顺序为：ACCC17537>ACCC17578>ACCC17675>ACCC17551。根干重中，菌株ACCC17512处理显著高于对照CK和Sm1021(P<0.05)，分别增长了74.8%和6.7%，其它各菌株处理根干重量由高到低的顺序为：ACCC17537>ACCC17578>ACCC17675>ACCC17551,见表6。

表6 ‘中苜3号’沙土盆栽接种根瘤菌比较Table 6 Comparison of different rhizobia strains inoculation in ‘Zhongmu No.3’ sand potted soil

3 讨论

大量试验研究表明，在不同的环境条件下，一种豆科植物可以与多种根瘤菌进行共生固氮，在同样环境条件，不同豆科植物可与同一根瘤菌共生固氮[10]。豆科植物与根瘤菌共生固氮的效率在不同植株和菌种之间的差异主要是由宿主植物基因和根瘤菌基因共同调控[11]。仅接种高效的根瘤菌，才能获得更好的苜蓿-根瘤菌共生固氮效果，从而提高苜蓿的产量与品质。

土壤环境对根瘤菌结瘤固氮效率具有很大的影响。根瘤菌接种效果在不同土壤类型中有很大差异，Hagen[12]在不同土壤类型中接种两种根瘤菌，沙土中根瘤菌数量在153天后下降为10个·g-1土，黏土则上升为103个·g-1土，与沙土相比，2种菌株在壤土和粘土土壤中建立得更好。本试验中‘龙牧806’和‘中苜3号’植株泥炭土中的长势均比好于沙土；沙土条件下由于植株长势较为缓慢，两品种均未达到测定全氮量的标准，可见2种土壤对苜蓿根瘤固氮有很大的影响。推测其原因可能是两种土壤营养元素含量不同导致的。有研究表明，影响苜蓿生长的主要因素是土壤中碱解氮、有效磷、速效钾等的含量。根瘤菌与豆科植物共生固氮对磷素十分敏感[13-15]。缺磷会抑制根瘤菌的固氮和吸收[16]。钾可以影响根瘤重量、根瘤数量和固氮效率。土壤中氮、磷、钾的含量保持一定的水平可以促进根瘤的生长，否则含量过低或过高都会产生抑制作用。本试验中泥炭土的碱解氮、有效磷、速效钾的含量均远远高于沙土的，在同样的接种条件下，泥炭土中的结瘤情况要好于沙土，说明土壤养分较为丰富更有利于根瘤的形成和植株的生长。

有效的根瘤菌含有豆血红蛋白，形成的根瘤为粉红色或红色；无效的根瘤菌一般没有豆血红蛋白，呈微白色或浅绿色[17]。本试验中在土壤灭菌的条件下，对照出现结瘤情况，说明种子中有内生根瘤菌，但均为白色无效根瘤，固氮能力低。在结瘤数量上，根据观察发现，泥炭土壤下‘龙牧806’接种菌株ACCC17675 根瘤数最多，为125.7个，但所结根瘤大部分个头小且颜色深；菌株ACCC17578所结根瘤虽然不多，有56.7个，但根瘤个头大且颜色粉红。沙土壤中，‘中苜3号’接种菌株ACCC17578所结根瘤最多，为76.3个，但是观察看到根瘤为白色。有报道表明，筛选出的有效菌株每年固氮可高达300公斤N·公顷-1；然而无效菌株一年仅仅只能提供30公斤N·公顷-1甚至更少，影响植株的生长[18]。

试验模拟自然条件筛选出不同土壤类型下‘龙牧806’和‘中苜3号’的共生固氮高效根瘤菌。但自然环境复杂，影响因素众多，要真正发挥高效根瘤菌在农业生产实践中的固氮作用，还要考虑土壤土著根瘤菌竞争等因素，在田间试验中进行高效根瘤菌的筛选匹配验证。此外，在实际紫花苜蓿生产中，要综合考虑土壤肥力、气候条件、土壤生物等环境因素，合理施用氮肥和接种根瘤菌，实现紫花苜蓿优质高产的生产目标。

4 结论

本研究表明，不同苜蓿品种、土壤条件和根瘤菌菌株对共生固氮有效性均存在差异。根据总根瘤数、株高、地上部干重、根干重和全氮量5项指标数据分析，筛选出优良匹配组合为泥炭土条件下为：‘龙牧806’-ACCC17578、‘中苜3号’-ACCC17551；沙土条件下为：‘龙牧806’-ACCC17675、‘中苜3号’-ACCC17512。试验结果进一步说明根瘤菌与豆科植物共生固氮是由根瘤菌菌株、寄主植株和环境条件共同调控的。