洪宏海,王 征,陈金桃

广州医科大学附属第三医院 检验科(广州510150)

肝癌是常见的恶性肿瘤，其致死率在肿瘤中排第3位[1]。肝癌的发病机制复杂多样，其具体分子机制尚未清楚[2]。大多数肝癌患者在诊断时已经处于肝癌晚期，其生存期一般小于1年，且发生远处转移[3]。肝癌发生远处转移是多因素、多步骤的过程[4]。肝癌侵袭是肝癌远处转移的关键步骤，其与蛋白金属酶MMP-2和MMP-9水平密切相关[5]。肝癌早期诊断和治疗可明显提高肝癌病人的生存期和生活质量[6]。目前,血清甲胎蛋白AFP是诊断肝癌的重要标志物[7]。但是，AFP的灵敏性和特异性只有60%和80%左右[8]。因此，寻找其它血清标志物辅助或联合AFP对肝癌诊断尤为重要。

Sortilin蛋白于1997年在人脑提取物中被发现，随后研究[9]发现其基因定位于人1号染色体，编码833个氨基酸，其分子量约为100 KD。Sortilin蛋白属于Vps10p结构域家族受体，为单跨膜受体,研究[10]发现其参与神经营养因子胞内分选及老年痴呆疾病发病。有研究[11]发现Sortilin蛋白在很多组织中表达，如大脑、脊髓、舉丸、甲状腺、心脏和骨豁肌等。Sortilin蛋白与肿瘤增殖和转移密切联系，如促进肾癌细胞、结直肠癌细胞、卵巢癌细胞增殖；Sortilin促进肾癌、乳腺癌侵袭及恶性[12]。但是，Sortilin蛋白在肝癌中的作用尚未清楚。在本研究中利用MTT法和Invasion assay研究Sortilin对肝癌的增殖和侵袭作用，并探讨其分子机制；同时用ELISA方法检测肝癌病人血清中Sortilin水平，分析其与AFP的相关性。此外，ROC曲线分析血清中Sortilin在肝癌诊断中的价值。

1 材料与方法

1.1 实验材料与标本收集

HepG2细胞由广州中医药大学药物研究所方淑环教授赠予。健康人和肝癌病人血清来自广州医科大学附属第三医院体检中心和检验科。所有病人资料和标本收集都严格按照广州医科大学伦理委员会相关规定。

1.2 试剂和耗材

Sortilin ELISA检测试剂盒购自CUSABIO公司。AFP ELISA检测试剂盒购自安图生物公司。小分子干扰RNA-Si-Sortilin购自锐博公司。MMP-2和MMP-9一抗购自CST公司。MTT购自北京鼎国公司。细胞培养皿购自康宁公司。Transwell小室购自BD公司。

1.3 Sortilin干扰小片段构建及转染

Sortilin干扰小片段购自锐博公司。Si-Sortilin片段序列及转染步骤见文献[13]。Sortilin干扰小片段干扰序列为：5'-CUCUGCUGUUAACAC CACC[dT][dT]-3'。转染步骤：HepG2细胞接种于6孔板中，待其融合度为60%左右，用转染试剂Lipo2000转染 Si-Sortilin片段，6 h后换液，24 h后进行MTT和Invasion assay实验或收集蛋白进行后续检测分析。

1.4 MTT法检测肝癌细胞增殖能力

取对数生长期肝癌细胞，接种到48孔细胞培养板中，每孔加入500 mL细胞悬液，置于37℃、5%CO2cell incubator中培养；细胞贴壁后其融合度达到60%左右，瞬时转染Sortilin干扰小片段Si-Sortilin，不同时间点(24、48、72 h)加入200 μL的MTT工作液(浓度为5 mg/mL)，继续培养4 h；去掉上清后每孔加入2 mL二甲基亚砜，用摇床震荡摇匀，以使蓝色结晶颗粒甲缵完全溶解，用酶标仪测定OD570的光密度值。实验中每个实验组设置3个重复的培养孔，重复进行3次。

1.5 Western blot检测蛋白金属酶MMP-2和MMP-9水平

收集处理好的HepG2细胞，加入裂解液，蛋白定量后进行蛋白电泳。电转后用5%脱脂牛奶封闭1 h，PBS洗3次，加入MMP-2和MMP-9一抗，4 ℃过夜，TPBST洗3次后加入二抗孵育1 h，然后TBST洗3次，最后加入ECL显色，拍照。

1.6 Invasion assay检测肝癌细胞侵袭转移能力

Invasion assay是用Boyden transwell小室来进行的。在进行Invasion assay实验前将Boyden transwell小室水化3 h，按照1∶3的比例用DMEM稀释matrixgel，然后吸取60 μL稀释后的matrixgel平均铺入Boyden transwell小室，37 ℃培养箱孵育1 h。细胞种植到6孔板中，等细胞融合度到达60%时，瞬时转入Sortilin干扰小片段Si-Sortilin，24 h后消化细胞；将消化的细胞置于15 mL离心管中，用无血清的培养液配制成一定浓度细胞悬液。于24孔板中先加入500 μL含有10%血清的培养液，把铺好matrixgel的transwell小室放到24孔板中，使transwell小室底端刚好接触到下面的培养液。以每孔加入1×105个细胞加入transwell小室的上室。在不同时间点取出transwell小室，用4%的多聚甲醛固定15 min。然后进行结晶紫染色30 min，用清水轻轻洗去多余结晶紫染液，用棉签小心擦去transwell小室里面的细胞，然后室温晾干，使用显微镜观察transwell小室外面细胞并拍照。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 Sortilin对肝癌细胞株HepG2生长作用

MTT检测Sortilin对肝癌细胞增殖作用。转染Sortilin干扰小片段Si-Sortilin后，在不同时间点24、48、72 h进行MTT实验。结果显示：与对照组相比，干扰Sortilin组肝癌细胞生长并没有受到影响(P>0.05)，表明Sortilin不影响肝癌细胞HepG2增殖(图1)。

图1 MTT法检测Sortilin对肝癌细胞株HepG2生长的作用

2.2 肝癌病人血清Sortilin水平升高且对肝癌诊断具有较好价值

Sortilin可分泌到血清中，且其可能作为心血管疾病和糖尿病诊断的血清标志物。用ELISA试剂盒检测血清中Sortilin水平,结果显示，与对照组相比，肝癌病人血清中Sortilin水平明显高于健康人(图2A)。此外，为了验证血清Sortilin对肝癌病人的诊断价值，本实验还进行了ROC曲线分析。结果显示，AUC面积为0.862，表明血清Sortilin水平对肝癌的诊断具有较好价值。同时ROC曲线分析表明血清Sortilin对肝癌诊断敏感性和特异性分别为77.1%和71.4%；其诊断的cut-off值为1 947.5，95%置信区间为0.776～0.947(图2B)。

图2 Sortilin在肝癌病人血清中水平及其ROC曲线分析

2.3 Sortilin促进肝癌细胞株HepG2侵袭

HepG2细胞转染干扰Sortilin的小分子干扰片段后进行Invasion assay实验。结果显示: 与对照组相比，HepG2组胞转染Sortilin小分子干扰片段后，侵袭穿过Transwell小室的细胞明显减少，表明干扰Sortilin后明显抑制肝癌细胞株HepG2侵袭能力(图3)。

图3 Invasion assay 检测Sortilin对肝癌细胞株HepG2侵袭作用(400X)注：A：对照组；B：干挠Sortilin组

2.4 干扰Sortilin后下调蛋白金属酶MMP-2和MMP-9水平

为了研究Sortilin促进肝癌细胞侵袭作用的分子机制，用Western blot检测干扰Sortilin后蛋白金属酶MMP-2和MMP-9水平。蛋白电泳结果显示，在肝癌细胞HepG2中干扰Sortilin后，蛋白金属酶MMP-2和MMP-9水平明显下调，提示Sortilin可能调控MMP-2和MMP-9水平促进肝癌细胞侵袭(图4)。

图4 Western blot检测HepG2细胞干扰Sortilin后蛋白金属酶MMP-2和MMP-9蛋白水平

2.5 肝癌病人血清Sortilin水平和AFP水平呈正相关

甲胎蛋白AFP是肝癌诊断重要指标之一。为了进一步探讨Sortilin与肝癌诊断的关系，本实验检测35例肝癌病人血清Sortilin水平和AFP水平(图 4A、5A)，然后进行相关性分析。结果显示，肝癌病人血清Sortilin水平和AFP水平呈正相关，差异具有统计学意义(P<0.01)(图5B)。

图5 肝癌病人血清Sortilin水平和AFP水平呈正相关注：A：ELISA法检测肝癌病人血清AFP水平；B：肝癌病人血清Sortilin水平和AFP水平相关性分析

3 讨论

肝癌是常见的恶性肿瘤，其死亡率在恶性肿瘤中排名前列[13]。肝癌的发病机制复杂多样，远处转移是其恶性特征之一[14]。随着手术和药物发展，肝癌治疗虽然取得一定进展，但是效果不佳，其主要原因是耐药或发生远处转移[15]。本研究发现沉默Sortilin后明显抑制肝癌细胞的侵袭能力，且下调蛋白金属酶MMP-2和MMP-9水平。进一步研究表明肝癌病人血清中也存在Sortilin蛋白，且对肝癌的诊断具有较好价值。此外，肝癌病人血清Sortilin蛋白与肝癌标志物AFP呈正相关。

研究[16-17]表明其与心血管疾病、老年痴呆、肿瘤密切相关。但是，Sortilin在肝癌中作用尚未清楚。有研究[18]报道Sortilin作为辅助受体，调控proBDNF诱导神经元细胞凋亡。因此，我们首先用MTT法检测Sortilin对肝癌细胞生长作用，结果表明其并不影响肝癌细胞HepG2生长，表明在不同种类细胞中，Sortilin对不同种类细胞生长作用并不一样，这种不同作用的分子机制尚未清楚。在肿瘤中，Sortilin可促进乳腺癌、结直肠癌的侵袭和转移。因此，我们下一步研究Sortilin对肝癌侵袭作用。侵袭实验表明，沉默Sortilin后，肝癌细胞的侵袭能力明显受到抑制。本实验结果提示，Sortilin在肿瘤侵袭中起着重要作用，可能成为治疗肿瘤的潜在靶点。蛋白金属酶MMP-2和MMP-9与肿瘤侵袭密切相关。本研究结果表明：沉默Sortilin后明显抑制MMP-2和MMP-9水平，Sortilin通过调控MMP-2和MMP-9水平，进而调控肝癌细胞的侵袭。

Sortilin蛋白不仅作为受体存在于细胞膜上，也可分泌到血清中，且其对心血管疾病诊断具有良好价值[19]。为了阐明血清中Sortilin蛋白与肝癌的关系，我们收集了35例肝癌病人血清和健康人血清，ELISA法检测其水平。结果显示肝癌病人血清中Sortilin含量明显高于健康人对照组。但是，Sortilin蛋白是如何分泌入血清中尚未清楚，值得我们进一步研究。此外，ROC曲线表明血清Sortilin对肝癌具有较好的诊断价值。这些结果表明Sortilin不仅仅影响肝癌侵袭能力，还可分泌到血清中，且有可能成为肝癌诊断的潜在标志物。

AFP是肝癌诊断的重要指标之一。但是，在许多疾病中AFP水平也升高，AFP在肝癌诊断中特异性仅为80%[20]。本研究表明：血清中Sortilin含量与AFP含量密切联系，呈正相关(P<0.001)，提示肝癌血清中Sortilin可辅助或联合AFP，提高肝癌诊断和疾病监测。

综上所述，本研究证明Sortilin通过调控蛋白金属酶MMP-2和MMP-9水平，进而调控肝癌细胞的侵袭；此外，血清中Sortilin含量与AFP呈正相关，且对肝癌诊断具有一定的价值。