王 建

在世界大部分地区，鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma)是1种罕见的恶性肿瘤，但是在东南亚、北非和我国南方(尤其是广东省)其发病率显著增高，国内称之为“广东癌”[1]。鼻咽癌恶性程度较高，易于转移且预后不良[2]。Nur77是1个孤儿核受体家族成员，参与调控多种恶性肿瘤的发生发展[3]。我们的前期研究发现微管相关蛋白与肿瘤的侵袭转移密切相关[4]。为了探讨Nur77在鼻咽癌转移过程中的作用及机制，本研究构建绿色荧光蛋白标记的Nur77基因慢病毒表达载体并稳定转染鼻咽癌CNE-2Z细胞，为后续实验奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

限制性内切酶(Thermo)；T4 DNA连接酶(Thermo)；DNA回收试剂盒(Magen)；KOD Plus DNA聚合酶(TOYOBO)；cloneez无缝重组试剂盒(金斯瑞)；质粒抽提试剂盒(康为)；LipofectaminTM3000(Invitrogen)；FItran：慢病毒包装专用转染试剂(辉骏生物)；Trypsin-EDTA(MP)；Polybrene(辉骏生物)；Pyrex®cloning cylinder(Sigma)。

1.2 质粒及细胞株

XL1-BLUE MRF'感受态细胞(辉骏生物)；慢病毒表达载体：pCDH-EGFP-G4S-MCS(辉骏生物)；慢病毒包装质粒：pMD2.G、psPAX2(辉骏生物)；HEK293T及CNE-2Z细胞。

1.3 方法

1.3.1 制备目的基因片段 根据人Nur77全长序列设计引物，上游引物为：5'-AATGAATTCGAATGCCCTGTATCCAAGCCCAA -3'，含EcoRI酶切位点；下游引物为：5'-AATGGATCCTCAGAAGGGCAGCGTGTCCATG-3'，含BamHI酶切位点。PCR反应体系如下：上下游引物各1 μl(10 μmol/L)、模板cDNA 1 μl、KOD Plus DNA聚合酶0.5 μl、10×聚合酶buffer 2 μl、ddH2O 12.5 μl、dNTP 2 μl。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 2 min，共25个循环；68 ℃ 5 min。扩增后，经1%琼脂糖凝胶电泳后回收目的片段。

1.3.2 构建重组表达载体 用EcoRI和BamHI酶切载体和片段，反应体系如下：10×buffer 6 μl、载体/基因片段10 μl、EcoRI酶 1 μl、BamHI酶1 μl、ddH2O 42 μl，于37 ℃酶切3 h，回收酶切后的质粒和基因片段；线性化质粒和基因连接，反应如下：基因片段2 μl、线性化载体3 μl、T4连接酶1 μl、10× T4 Buffer 2 μl、ddH2O 12 μl，16 ℃连接过夜。

1.3.3 转化感受态细胞及菌落检测 感受态细胞加入10 μl DNA混匀，冰浴30 min；转化管于42 ℃循环水浴锅中热激90 s后冰浴3 min；每管加入500 μl SOC液体培养基，37 ℃振荡培养1 h，使细菌复苏；……