闵文光，余慧宏，魏建萍，涂智杰，吴建英，宋建新

(景德镇市疾病预防控制中心，江西 景德镇 333000)

微生物引起的食源性疾病中，志贺菌，大肠埃希菌O157与副溶血性弧菌引起的食源性疾病占据了大多数。传统检测方法的操作步骤过于繁琐，工作量大，检测周期长，不能及时为食源性疾病爆发和食物中毒提供有效的线索[5]。本研究旨在建立一种快速同时检测三种病原菌的多重PCR方法。有文献报道，志贺菌侵袭性质粒抗原H的IpaH基因[1]、副溶血性弧菌t1基因[2]，大肠埃希菌O157的eaeA基因[3，4]均具有很高的特异性，在这些文献研究中已得到验证。通过对三种致病菌的基因进行分析，设计出各自特异性PCR引物，通过对病原学标本的合理处理，PCR反应条件的摸索，能同时对三种病原菌进行PCR扩增。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株实验所用菌株共8株，分别为志贺菌(ATCC10412)、大肠埃希菌 O157(ATCC43888)、肠道致病性大肠埃希氏菌(ATCC11775)、产肠毒素性大肠埃希菌 (ATCC35401)、 金黄色葡萄球菌(ATCC29213)、单核细胞增生李斯特菌(CMCC54004)、蜡样芽孢杆菌(CMCC(B)63303)、副溶血性弧菌（ATCC17802）。所有菌株均为本实验室保藏菌株。

1.1.2 培养基LB培养液组成成份 胰蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L、酵母提取物 5g/L，用 40g/LNaOH 调pH至7.0。

1.1.3 试剂及仪器 Taq DNA聚合酶、dNTP、Mg-Cl2、10×PCR buffer购于上海生工；引物由上海生工合成；DL2000DNA Marker、溴化乙锭购于大连宝生物工程有限公司；琼脂糖为西班牙Biowest公司产品。PTC-200PCR仪为美国MJ公司产品；LEGEND MICRO 21Centrifuge高速离心机为美国Thermo Scientific公司生产；FLY-211B恒温摇床；DYY-6C电泳仪为北京六一仪器厂生产；GelDoc 2000凝胶成像系统为美国Bio-Rad公司生产。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 根据志贺菌侵袭性质粒抗原H的IpaH基因[1]、副溶血性弧菌t1基因[2]，大肠埃希菌 O157 的 eaeA 基因[3，4]设计 3 对引物（表 1）。……