邵 凯 宿建丽 刘骞文 赵晓云

(山东大学齐鲁医院(青岛)检验医学中心，山东 青岛 266000)

肥胖时脂肪组织扩张导致脂肪细胞肥大和数量增生，从而诱导葡萄糖和脂类代谢失调。而脂肪组织增加破坏了机体能量平衡，提高了胰岛素抵抗(IR)、高血压和血脂异常的风险。正确理解脂肪细胞的分化将提供有价值的信息，有助于全面有效治疗肥胖策略的制定。脂肪细胞的分化发生在几个不同阶段，涉及许多信号通路，其关键是一系列严格控制的转录因子的调控。过氧物酶体增殖物激活受体(PPAR)属于核受体超家族成员，与肥胖及脂代谢相关疾病的发生关系密切。PPARα和脂肪细胞脂肪酸结合蛋白(aP)2被称为脂肪细胞的分化标记。此外，最新研究报道小分子核糖核酸(miRNA)参与了脂肪细胞的分化〔1，2〕。miRNA是19～22个核苷酸非编码RNA的碎片，通过转录后调控目标靶基因，在不同的生理过程中扮演了重要的角色。研究表明，miRNA在能量代谢〔3〕，糖和脂代谢〔4〕，胰岛素分泌〔5〕和脂肪细胞分化〔6，7〕等过程中都发挥重要作用。有研究证实miR-152在小鼠的3T3-L1细胞分化过程中表达明显上调，引入反义寡核苷酸的miR-152，可抑制脂联素基因的表达，提示miR-152在前脂肪细胞分化过程中发挥重要作用〔2〕。然而，脂肪细胞分化过程中miR-152 表达改变及其分子机制尚不完全清楚。本研究检测3T3-L1细胞分化过程中miR-152和PPAR信号系统相关基因的表达变化，进一步探讨肥胖的发病机制。

1 材料与方法

1.1实验材料 3T3-L1前体脂肪细胞(购于中国科学院上海细胞库)，DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶和Trizol等由美国Invitrogen公司提供，胰岛素、葡萄糖、地塞米松、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(MIX)和油红O染料由Sigma公司提供，转录试剂盒、miR-152特异引物和荧光定量PCR试剂盒由美国ABI公司提供。

1.23T3-L1前体脂肪细胞培养和诱导分化 细胞状态良好时接种于培养板，使用完全培养基(DMEM+10%FBS+100 U/ml青、链霉素)，在37℃细胞培养箱(5%二氧化碳，95%空气)中进行培养，每2 d换液1次。观察细胞生长完全融合2 d后，加入分化诱导液，培养2 d，换只含2 μmol/L胰岛素的完全培养基，再培养2 d，换成不加任何诱导剂的完全培养基，以后每2 d换液1次，直至第9天培养至85%～95%的3T3-L1细胞都分化为成熟脂肪细胞，用油红O染色细胞质内有大量亮红色脂肪滴，提示3T3-L1前体脂肪细胞分化成功。分别收集诱导分化第0天、3天、6天和9天的培养细胞待检。

1.3荧光定量PCR检测 应用miRNA提取试剂盒(美国ABI 公司)提取附睾脂肪miRNA，应用miR-152特异反转录和扩增，引物均在美国ABI 公司合成。miR-152反转录引物序列：miR-152：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC-CCAAGT-3′;U6：5′GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG GTATTCGCACTGGATACGACA-AAATATG-3′。miR-152定量PCR引物：U6：5′-GCGCGTCGTGAAGC GTTC-3′；miR-152:5′-TCAGTGCATGACAGA-3′;通用引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。使用Trizol一步法提取各组脂肪细胞总RNA，逆转录合成cDNA。qPCR引物由上海生工生物工程技术公司合成，PPARγ上游5′-CCCACCAACTTCGGAATCAG-3′,下游5′-TGCTGGAG-AAATCAACTGTGGTA-3′；aP2上游5′-GTGATGCCTTTGTGGGAACCTGGAAG-3′，下游5′-GTGATGCCTTTGT-GGGAACCTGGAAG-3′;PPARα上游5′-TGAACAAAGA-CGGGATG-3′，下游5′-TCAAACTTGGGTTCCATG-AT-3′;GAPDH上游5′-GACCCCTTCATTGACCTCAAC-3′，下游5′-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3′。于ABI 公司Prism 7000荧光定量PCR仪进行扩增，反应条件：95℃ 10 min，1个循环；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40个循环，于72℃ 延伸10 min。扩增结束后，以限制点的循环数(CT)计算目的基因的相对表达量。

1.4统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行方差分析、t检验及直线相关分析。

2 结 果

2.1脂肪细胞分化过程中基因表达的改变 诱导6～9 d，细胞质内有大量亮红色脂肪滴，提示3T3-L1前体脂肪细胞分化完成。分化过程0 d、3 d、6 d和9 d观察期内，miR-152表达量持续增加，至第6天达到峰值，PPAR-α、PPAR-γ和aP2表达量均呈现持续增加趋势(表1)。

表1 3T3-L1前体脂肪细胞分化过程中各基因的表达量

与其他时间点比较：1)P<0.05

2.2miR-152与PPAR信号通路的相关性 脂肪细胞分化过程中miR-152表达增加，与PPARα基因表达呈正相关(r=0.958，P<0.01)，与PPARγ和aP2基因上调也呈正相关(r=0.667，0.697，P<0.05)(图1)。

图1 3T3-L1前体脂肪细胞分化过程miR-152与各基因表达相关性

3 讨 论

肥胖引起的脂肪细胞增生和肥大与各种代谢紊乱有关，研究脂肪形成和脂类代谢的分子机制非常重要。有研究表明 miRNA可以直接或间接调节脂肪细胞的分化，miRNA可以作用于脂肪形成的各个要素，调控脂肪细胞分化关联基因表达改变〔7〕，从而调控脂肪形成，调节脂类代谢〔8〕。此外，最近的研究提出有些miRNA可以作为肥胖的生物标志物，但仍有许多问题有待解决。miRNA和目标基因在脂肪形成的过程存在复杂交互作用，其机制尚未完全阐明，需要进一步解释这些miRNA的作用及其对脂肪形成的监管机制。本研究发现miR-152可能通过直接调节PPAR信号系统参与3T3-L1前脂肪细胞分化过程。

基因差异性表达是细胞分化的本质。前脂肪细胞可以在多种转录因子的调控下，通过激活或抑制分化相关基因，经过复杂的过程分化成为成熟脂肪细胞。PPAR信号通路是一类能被过氧化物酶体增殖物激活的受体，其包含多种亚型，其在机体葡萄糖和脂质代谢平衡中发挥关键的作用〔1～3〕，能够调节脂肪的分化形成。

研究指出，人皮下脂肪组织过表达miR-519d与严重肥胖有关〔8〕。miR-519能够结合于PPARα的3′UTR。尽管在肥胖受试者中PPAR miRNA高度表达，但与对照组相比，其蛋白几乎检测不到。miRNA和蛋白之间的表达差异表明PPAR蛋白可能受到转录后调控。在脂肪生成过程中，miR-519d的激活呈现剂量依赖性，这表明miR-519d可能是脂肪细胞肥大的一个因素，引起肥胖人群脂肪组织的大规模增加。在肥胖或脂肪细胞分化中还未有miR-519d差异表达的报道。此外，在3T3-L1脂肪细胞中，miR-21能够通过调控PTEN-AKT通路来逆转高糖和高胰岛素引起的IR，因此miR-21可以作为一个预防和治疗IR和其他代谢疾病的新的潜在靶标〔9〕。

在对肥胖脂肪细胞的不同研究中，由于细胞类型的多样性使得对miRNA表达的解释存在差异。有预测报道miR-27a和miR-130可以特异性结合在PPAR3′UTR末端。依照这些预测，实验证实miR-27a和miR-130确实可以通过下调PPAR来抑制脂肪细胞的分化〔10，11〕。miR-27a和miR-130的表达水平在脂肪生成过程中逐渐减少，与PPAR的表达水平相反。过表达的miR-27a和miR-130 可能抑制了PPAR蛋白表达，从而抑制脂肪细胞的分化。而改变PPAR也会导致皮下和腹部脂肪组织中miRNA表达发生变化〔10〕。

本研究发现miR-152在小鼠的3T3-L1细胞分化过程中表达明显上调，在前脂肪细胞引入反义寡核苷酸的miR-152，可抑制脂联素基因的表达，这表明miR-152在脂肪细胞的分化过程中发挥作用〔2〕。我们前期研究发现，高浓度葡萄糖可以诱导肝细胞miR-152下调，损伤AKT/GSK途径，参与肝脏IR发病〔12〕。然而，脂肪组织miR-152 在肥胖和IR的发病中的作用是未知的。本研究初步证实脂肪细胞分化过程中miR-152表达增加，直接上调PPAR、PPAR和aP2基因表达，参与肥胖发病呈正相关。miRNA表达谱的研究已经鉴定出一些参与脂肪形成并与肥胖有关的miRNAs，但探寻这些miRNA在脂肪组织中参与调控的作用仍然面临着挑战〔8〕。因此，研究miRNA 的转录与生物的合成和降解间是否有平行的变化是非常有意义的，这可以解释在肥胖中观测到的异常调节的miRNA。此外，其他细胞外压力和养分供应调控肥胖相关的miRNA的作用还不清楚。最新研究发现miRNA被分泌到细胞外液，建立一个血浆miRNA谱对于区分健康和肥胖受试者是十分重要的。潜在血浆miRNA表达谱可以应用于肥胖管理和跟踪治疗。进一步鉴定和表征与脂肪形成和肥胖相关的miRNA能够提供新一代的治疗方案和策略，推进新的抗肥胖治疗的发展。