陈迎春 刘中香 王亚梅 李艳红 董燕飞 相聪坤

(河北省中医院药学部，河北 石家庄 050011)

β细胞受损引起胰岛素分泌量降低，出现高血糖，引发1型糖尿病〔1〕。目前，治疗糖尿病的主要手段为口服药物、外源性胰岛素的引入及胰岛移植，但极易产生不对症、胰岛素耐受、移植胰岛供体不足及排异现象〔2，3〕，因此尚无理想的治疗手段。研究证实，骨髓间充质干细胞可诱导分化为胰岛β细胞〔4〕，脐血间充质干细胞也具有胰岛β细胞的分化能力〔5～7〕，人羊膜间充质干细胞亦可分化为胰岛素分泌细胞〔8，9〕。脂肪间充质干细胞(ADSCs)同样具有多向分化潜能。研究发现，葛根芩连汤对糖尿病有一定的改善功效〔10，11〕。但有关葛根芩连汤联合ADSCs移植治疗糖尿病的研究尚不充分〔12～14〕。本研究探讨联合葛根芩连汤和ADSCs移植治疗对糖尿病大鼠肾功能的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 健康Wistar大鼠75只由河北医科大学动物实验中心提供，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK(京)2009-0054。60～65日龄，体重200～240 g，环境：23～27℃，恒温，湿度50%～70%，喂养饲料：颗粒型普通大鼠饲料及消毒无菌水，大鼠自由饮水和进食，实验前1 d禁食不禁水。

1.2主要材料及来源 L-DMEM培养基、胎牛血清、混合抗生素(青霉素、链霉素)、柠檬酸-柠檬酸钠、链脲佐菌素(STZ)均购自GIBCO公司，胰蛋白酶购于sigma公司，胰岛素ELISA试剂盒(大鼠)购于Excell公司，实验中对动物处置方法符合动物伦理学要求。PKH-26(Sigma公司)；二氧化碳培养箱购于上海人和科技有限公司，全自动生化仪购自日立公司(型号7170S)。超净工作台(苏州安泰空气技术公司) 和荧光倒置显微镜(日本Nikon公司)。

1.3体外复苏并培养ADSCs和标记 取出实验室保存的ADSCs，以防冷冻管爆裂，置于37℃水浴，不间歇、轻轻摇动冷冻管，快速融解后放置于无菌操作台中，吸取细胞悬浮液。加至预先配置好的1∶10倍稀释的L-DMEM培养基(胎牛血清与青霉素、链霉素混合，抗生素按10∶1比例配置)。于培养瓶中接种细胞，并静置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。每2 d更换新鲜培养液，除去未贴壁细胞，至细胞融合85%时去除培养基，吸取贴壁细胞，加至培养皿中，3 g/L胰酶消化5 min，用已配置的等体积的10%胎牛血清低糖培养基终止消化，细胞吹打成悬液，1 500 r/min，离心5 min，弃去上清非贴壁细胞，在新配置的无菌培养基中调节浓度，依照上述方法进行培养。2～3 d更换新鲜培养基，第五代P5供于该研究，吸取PKH-26液5 μl至1.5 ml的EP管中，加入1 ml完全培养液，吹打均匀，即得PKH-26标记液。取贴壁达90%融合的细胞，吸弃培养液，磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，加入上述标记液40 μl/cm2，于37℃、5%CO2、饱和湿度恒温培养箱中孵育20 min，吸弃标记液，加入37℃的完全培养液5 ml，孵育，10 min后吸弃，继续加入培养液重复清洗2次。培养24 h后在倒置荧光显微镜下观察PKH-26标记效果和细胞形态变化。随机选取5个视野，计数PKH-26阳性细胞数及细胞总数，计算标记率。标记率=视野内阳性细胞总数/视野内细胞总数×100%。移植时PBS洗涤细胞3次，将终浓度调为1×1010/L备用。

1.41型糖尿病大鼠模型建立及分组 75只Wistar大鼠随机分为5组，分别为正常对照组、糖尿病组、葛根芩连汤组、ADSCs移植组和联合葛根芩连汤和ADSCs移植(联合)组，每组15只。预先配置pH=4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，并用此稀释STZ为2% STZ注射液。5组均禁食12 h，正常对照组连续5 d于腹腔注射0.1 mol的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，其余4组连续5 d于大鼠腹腔静脉注射40 mg/kg的STZ注射液。并于尾部静脉取血检测造模结果。造模4 w后，葛根芩连汤组和联合组灌胃葛根芩连汤，参考《伤寒论》取葛根250 g，黄连150 g，黄芩150 g，甘草100 g，用10倍重量的水对葛根与其余中药分开浸泡20 min，先煮葛根20 min，然后加入其余已侵泡的药汤继续煮40 min，滤出汤剂，第二煎加入8倍重量的水，煎煮30 min，混合二次煎剂，浓缩至全方生药量 2 g/ml，给予葛根芩连汤水煎液生药量10 g/kg灌胃。糖尿病组灌胃等量生理盐水。持续6 w正常饲养。ADSCs移植组和联合组大鼠尾部注射300 μl ADSCs悬液(含5×106cell)。

1.5移植治疗8 w后测定各组血糖、血清胰岛素、血肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)及24 h尿蛋白的水平 移植治疗第8周，各组行眼眶取血测量血糖。于第8周用乙醚麻醉各组大鼠，经大鼠主动脉取血，取部分血浆按胰岛素ELISA试剂盒说明书的方法，测定5组血清胰岛素浓度。另取部分血液，室温下，5 000 r/min，离心3 min，保留血清移去沉渣，-80℃保存备用。肌酐测试(苦味酸不除蛋白法)试剂盒和BUN(OPA法)试剂盒分别用来测定SCr和BUN。SCr测试(苦味酸不除蛋白法)试剂盒组成为：R1 氢氧化钠0.2 mol/L，苦味酸25 mmol/L。BUN(OPA法)试剂盒原理组成为R1：HADH、叠氮钠。R2：α-酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶、尿酸、叠氮钠。移植治疗第8周，收集各组24 h尿液，混匀，用移液枪各取尿量5 ml，5 000 r/min，离心3 min，吸取上清液，放入全自动生化仪，检测24 h尿蛋白水平。

1.6荧光显微镜观测PKH-26标记的ADSCs存活及分布 荧光显微镜观察过程中保持低温，保留组织微结构完整。于移植细胞后8 w对组织切片进行观察，每张切片在高倍镜(×200)下任取10个视野，计算每个视野中的PKH-26 阳性细胞数，取其均值。

1.7大鼠体重、肾重测量 于移植治疗第8周后，测量正常对照组、糖尿病组、葛根芩连汤组、ADSCs移植组和联合组体重，称重3次取均值。后对以上5组大鼠腹腔麻醉，取左右双肾组织，置于培养皿中称重，计算肾重/体重比值。

1.8统计学方法 应用SPSS13.0软件行单因素方差分析。

2 结 果

2.1ADSCs的观察 分别在显微镜下观察原代和P5代的ADSCs形态。原代的ADSCs形态各异，显微镜下可见菱形、圆形、不规则形，体积偏小，且可见少量杂质细胞。当细胞融合达到85%左右时，反复培养和传代，细胞传至第5代时，细胞多呈现长窄梭形，形态较规则，生长速度增快，出现细胞伪足，体积增大，未能观察到杂细胞(图1)。

图1 体外培养ADSCs(×200)

2.2各组血糖、血清胰岛素、SCr和BUN及24 h尿蛋白水平 与糖尿病组比较，ADSCs移植组、葛根芩连汤组、联合组血糖、SCr和BUN及24 h尿蛋白明显降低，血清胰岛素明显升高(P<0.05)，联合组更显著(P<0.01)。见表1。

2.3PKH-26 标记的ADSCs存活及分布 荧光显微镜下观察，联合组PKH-26阳性细胞最多，见图2。葛根芩连汤组、糖尿病组及正常对照组中均未发现被PKH-26染色的细胞。

表1 各组血糖、血清胰岛素、SCr和BUN及24 h尿蛋白水平比较

与糖尿病组比较：1)P<0.05,2)P<0.01；表2同

图2 ADSCs存活及分布(×200)

2.4各组体重、肾重变化 联合组体重最接近正常对照组，且与ADSCs移植组和葛根芩连汤组体重相比，均有所升高，ADSCs移植组和葛根芩连汤组体重最低。肾重/体重比值即肾重指数：正常对照组最低，联合组低于ADSCs移植组和葛根芩连汤组但稍高于正常对照组，糖尿病组肾重指数最高，可达0.82。各组间差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 各组体重、肾重及肾重指数

3 讨 论

糖尿病最主要的危害是引起全身多器官慢性损伤，出现功能障碍，其中肾器官衰竭为最常见的器官损伤之一〔15～17〕。目前已有的治疗糖尿病的方法均不能从根本上治愈。随着基因工程的发展，研究者试图利用干细胞的分化特性，分化出具有健全功能特性的胰岛β细胞，改善机体胰岛β细胞的水平。间充质干细胞在脂肪中存在较多，具有高分化潜能。脂肪间充质干细胞与其他间充质干细胞在多向分化、基因转导等生理特性上并无明显差异〔18〕，另外脂肪间充质干细胞具有方便取材、来源量大、具有较快增殖速度等优势，已成为越来越多的研究者关注对象〔19〕。大量研究结果表明，可高度自我复制和多向分化的脂肪间充质干细胞可分化为胰岛β细胞〔20，21〕。葛根芩连汤在我国历史悠久，古人用葛根芩连汤治疗湿热引起的痢疾、腹泻，现代医学则已证实其可应用于各科疾病，葛根芩连汤有消渴作用〔22〕，其在治疗2型糖尿病上有一定的效果〔23〕，已有文献证实了葛根芩连汤可降血糖、调血脂〔24〕，研究者发现葛根芩连汤对多种动物模型均有降血糖功效〔25〕，其机制可能是该汤剂促进了肝糖原的合成。

ADSCs在体外复苏和培养简便易行，为后期的动物移植提供了充分的原料。比较5组大鼠的血糖、血清胰岛素、血SCr和BUN及24 h尿蛋白可知，ADSCs移植和葛根芩连汤联用，可以有效控制大鼠的上述指标，测试结果均最接近正常对照组。而ADSCs移植组、葛根芩连汤组大鼠血糖、SCr和BUN及24 h尿蛋白水平与糖尿病组相比明显降低，血清胰岛素明显升高，提示单一使用ADSCs移植或单一灌胃葛根芩连汤对大鼠的血糖、SCr和BUN及24 h尿蛋白水平也有一定的改善。通过显微镜观察也可发现，ADSCs在联合组大鼠肾脏中分布广于ADSCs移植组，因此葛根芩连汤对ADSCs是有促进作用的。大鼠肾重指数也证实，联合治疗可对糖尿病大鼠肾脏起到保护作用。