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葛根芩连汤联合脂肪间充质干细胞移植对糖尿病大鼠肾功能的影响

2018-08-15陈迎春刘中香王亚梅李艳红董燕飞相聪坤

中国老年学杂志 2018年15期
关键词:连汤葛根芩充质

陈迎春 刘中香 王亚梅 李艳红 董燕飞 相聪坤

(河北省中医院药学部,河北 石家庄 050011)

β细胞受损引起胰岛素分泌量降低,出现高血糖,引发1型糖尿病〔1〕。目前,治疗糖尿病的主要手段为口服药物、外源性胰岛素的引入及胰岛移植,但极易产生不对症、胰岛素耐受、移植胰岛供体不足及排异现象〔2,3〕,因此尚无理想的治疗手段。研究证实,骨髓间充质干细胞可诱导分化为胰岛β细胞〔4〕,脐血间充质干细胞也具有胰岛β细胞的分化能力〔5~7〕,人羊膜间充质干细胞亦可分化为胰岛素分泌细胞〔8,9〕。脂肪间充质干细胞(ADSCs)同样具有多向分化潜能。研究发现,葛根芩连汤对糖尿病有一定的改善功效〔10,11〕。但有关葛根芩连汤联合ADSCs移植治疗糖尿病的研究尚不充分〔12~14〕。本研究探讨联合葛根芩连汤和ADSCs移植治疗对糖尿病大鼠肾功能的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 健康Wistar大鼠75只由河北医科大学动物实验中心提供,购于北京华阜康生物科技股份有限公司,许可证号:SCXK(京)2009-0054。60~65日龄,体重200~240 g,环境:23~27℃,恒温,湿度50%~70%,喂养饲料:颗粒型普通大鼠饲料及消毒无菌水,大鼠自由饮水和进食,实验前1 d禁食不禁水。

1.2主要材料及来源 L-DMEM培养基、胎牛血清、混合抗生素(青霉素、链霉素)、柠檬酸-柠檬酸钠、链脲佐菌素(STZ)均购自GIBCO公司,胰蛋白酶购于sigma公司,胰岛素ELISA试剂盒(大鼠)购于Excell公司,实验中对动物处置方法符合动物伦理学要求。PKH-26(Sigma公司);二氧化碳培养箱购于上海人和科技有限公司,全自动生化仪购自日立公司(型号7170S)。超净工作台(苏州安泰空气技术公司) 和荧光倒置显微镜(日本Nikon公司)。

1.3体外复苏并培养ADSCs和标记 取出实验室保存的ADSCs,以防冷冻管爆裂,置于37℃水浴,不间歇、轻轻摇动冷冻管,快速融解后放置于无菌操作台中,吸取细胞悬浮液。加至预先配置好的1∶10倍稀释的L-DMEM培养基(胎牛血清与青霉素、链霉素混合,抗生素按10∶1比例配置)。于培养瓶中接种细胞,并静置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。每2 d更换新鲜培养液,除去未贴壁细胞,至细胞融合85%时去除培养基,吸取贴壁细胞,加至培养皿中,3 g/L胰酶消化5 min,用已配置的等体积的10%胎牛血清低糖培养基终止消化,细胞吹打成悬液,1 500 r/min,离心5 min,弃去上清非贴壁细胞,在新配置的无菌培养基中调节浓度,依照上述方法进行培养。2~3 d更换新鲜培养基,第五代P5供于该研究,吸取PKH-26液5 μl至1.5 ml的EP管中,加入1 ml完全培养液,吹打均匀,即得PKH-26标记液。取贴壁达90%融合的细胞,吸弃培养液,磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次,加入上述标记液40 μl/cm2,于37℃、5%CO2、饱和湿度恒温培养箱中孵育20 min,吸弃标记液,加入37℃的完全培养液5 ml,孵育,10 min后吸弃,继续加入培养液重复清洗2次。培养24 h后在倒置荧光显微镜下观察PKH-26标记效果和细胞形态变化。随机选取5个视野,计数PKH-26阳性细胞数及细胞总数,计算标记率。标记率=视野内阳性细胞总数/视野内细胞总数×100%。移植时PBS洗涤细胞3次,将终浓度调为1×1010/L备用。

1.41型糖尿病大鼠模型建立及分组 75只Wistar大鼠随机分为5组,分别为正常对照组、糖尿病组、葛根芩连汤组、ADSCs移植组和联合葛根芩连汤和ADSCs移植(联合)组,每组15只。预先配置pH=4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液,并用此稀释STZ为2% STZ注射液。5组均禁食12 h,正常对照组连续5 d于腹腔注射0.1 mol的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,其余4组连续5 d于大鼠腹腔静脉注射40 mg/kg的STZ注射液。并于尾部静脉取血检测造模结果。造模4 w后,葛根芩连汤组和联合组灌胃葛根芩连汤,参考《伤寒论》取葛根250 g,黄连150 g,黄芩150 g,甘草100 g,用10倍重量的水对葛根与其余中药分开浸泡20 min,先煮葛根20 min,然后加入其余已侵泡的药汤继续煮40 min,滤出汤剂,第二煎加入8倍重量的水,煎煮30 min,混合二次煎剂,浓缩至全方生药量 2 g/ml,给予葛根芩连汤水煎液生药量10 g/kg灌胃。糖尿病组灌胃等量生理盐水。持续6 w正常饲养。ADSCs移植组和联合组大鼠尾部注射300 μl ADSCs悬液(含5×106cell)。

1.5移植治疗8 w后测定各组血糖、血清胰岛素、血肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)及24 h尿蛋白的水平 移植治疗第8周,各组行眼眶取血测量血糖。于第8周用乙醚麻醉各组大鼠,经大鼠主动脉取血,取部分血浆按胰岛素ELISA试剂盒说明书的方法,测定5组血清胰岛素浓度。另取部分血液,室温下,5 000 r/min,离心3 min,保留血清移去沉渣,-80℃保存备用。肌酐测试(苦味酸不除蛋白法)试剂盒和BUN(OPA法)试剂盒分别用来测定SCr和BUN。SCr测试(苦味酸不除蛋白法)试剂盒组成为:R1 氢氧化钠0.2 mol/L,苦味酸25 mmol/L。BUN(OPA法)试剂盒原理组成为R1:HADH、叠氮钠。R2:α-酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶、尿酸、叠氮钠。移植治疗第8周,收集各组24 h尿液,混匀,用移液枪各取尿量5 ml,5 000 r/min,离心3 min,吸取上清液,放入全自动生化仪,检测24 h尿蛋白水平。

1.6荧光显微镜观测PKH-26标记的ADSCs存活及分布 荧光显微镜观察过程中保持低温,保留组织微结构完整。于移植细胞后8 w对组织切片进行观察,每张切片在高倍镜(×200)下任取10个视野,计算每个视野中的PKH-26 阳性细胞数,取其均值。

1.7大鼠体重、肾重测量 于移植治疗第8周后,测量正常对照组、糖尿病组、葛根芩连汤组、ADSCs移植组和联合组体重,称重3次取均值。后对以上5组大鼠腹腔麻醉,取左右双肾组织,置于培养皿中称重,计算肾重/体重比值。

1.8统计学方法 应用SPSS13.0软件行单因素方差分析。

2 结 果

2.1ADSCs的观察 分别在显微镜下观察原代和P5代的ADSCs形态。原代的ADSCs形态各异,显微镜下可见菱形、圆形、不规则形,体积偏小,且可见少量杂质细胞。当细胞融合达到85%左右时,反复培养和传代,细胞传至第5代时,细胞多呈现长窄梭形,形态较规则,生长速度增快,出现细胞伪足,体积增大,未能观察到杂细胞(图1)。

图1 体外培养ADSCs(×200)

2.2各组血糖、血清胰岛素、SCr和BUN及24 h尿蛋白水平 与糖尿病组比较,ADSCs移植组、葛根芩连汤组、联合组血糖、SCr和BUN及24 h尿蛋白明显降低,血清胰岛素明显升高(P<0.05),联合组更显著(P<0.01)。见表1。

2.3PKH-26 标记的ADSCs存活及分布 荧光显微镜下观察,联合组PKH-26阳性细胞最多,见图2。葛根芩连汤组、糖尿病组及正常对照组中均未发现被PKH-26染色的细胞。

表1 各组血糖、血清胰岛素、SCr和BUN及24 h尿蛋白水平比较

与糖尿病组比较:1)P<0.05,2)P<0.01;表2同

图2 ADSCs存活及分布(×200)

2.4各组体重、肾重变化 联合组体重最接近正常对照组,且与ADSCs移植组和葛根芩连汤组体重相比,均有所升高,ADSCs移植组和葛根芩连汤组体重最低。肾重/体重比值即肾重指数:正常对照组最低,联合组低于ADSCs移植组和葛根芩连汤组但稍高于正常对照组,糖尿病组肾重指数最高,可达0.82。各组间差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 各组体重、肾重及肾重指数

3 讨 论

糖尿病最主要的危害是引起全身多器官慢性损伤,出现功能障碍,其中肾器官衰竭为最常见的器官损伤之一〔15~17〕。目前已有的治疗糖尿病的方法均不能从根本上治愈。随着基因工程的发展,研究者试图利用干细胞的分化特性,分化出具有健全功能特性的胰岛β细胞,改善机体胰岛β细胞的水平。间充质干细胞在脂肪中存在较多,具有高分化潜能。脂肪间充质干细胞与其他间充质干细胞在多向分化、基因转导等生理特性上并无明显差异〔18〕,另外脂肪间充质干细胞具有方便取材、来源量大、具有较快增殖速度等优势,已成为越来越多的研究者关注对象〔19〕。大量研究结果表明,可高度自我复制和多向分化的脂肪间充质干细胞可分化为胰岛β细胞〔20,21〕。葛根芩连汤在我国历史悠久,古人用葛根芩连汤治疗湿热引起的痢疾、腹泻,现代医学则已证实其可应用于各科疾病,葛根芩连汤有消渴作用〔22〕,其在治疗2型糖尿病上有一定的效果〔23〕,已有文献证实了葛根芩连汤可降血糖、调血脂〔24〕,研究者发现葛根芩连汤对多种动物模型均有降血糖功效〔25〕,其机制可能是该汤剂促进了肝糖原的合成。

ADSCs在体外复苏和培养简便易行,为后期的动物移植提供了充分的原料。比较5组大鼠的血糖、血清胰岛素、血SCr和BUN及24 h尿蛋白可知,ADSCs移植和葛根芩连汤联用,可以有效控制大鼠的上述指标,测试结果均最接近正常对照组。而ADSCs移植组、葛根芩连汤组大鼠血糖、SCr和BUN及24 h尿蛋白水平与糖尿病组相比明显降低,血清胰岛素明显升高,提示单一使用ADSCs移植或单一灌胃葛根芩连汤对大鼠的血糖、SCr和BUN及24 h尿蛋白水平也有一定的改善。通过显微镜观察也可发现,ADSCs在联合组大鼠肾脏中分布广于ADSCs移植组,因此葛根芩连汤对ADSCs是有促进作用的。大鼠肾重指数也证实,联合治疗可对糖尿病大鼠肾脏起到保护作用。

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