孙晓婷 李 魏 于 睿 张 欢 毛智慧 刘晓亭

(辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847)

肌肉衰减综合征由美国学者Rosenberg〔1〕于1997年首先提出，用以描述骨骼肌老化的进程，其质量及力量均呈显著下降趋势。2010年，老年肌肉衰减综合征欧洲工作组(EWGSOP)的报告〔2〕，将肌肉衰减综合征定义为，以老年人骨骼肌质量和骨骼肌力量及功能的降低为主要特征的退行性病征，主要强调肌肉质量和肌肉功能的下降。肌肉衰减综合征的发生与衰老过程中线粒体介导的细胞凋亡信号通路的密切联系应值得关注，而作为细胞凋亡的调控中心，线粒体可通过Caspase依赖性信号通路Caspase非依赖性信号通路介导细胞凋亡〔3〕。本实验探讨穴位贴敷疗法对肌肉衰减综合征大鼠Caspase-3和Caspase-8的影响。

1 材料与方法

1.1动物 雄性大鼠20只，清洁级，体重210～240 g，购自辽宁长生生物技术有限公司，许可证号SCXK-(辽)2015-0001。购入后于本学校实验中心动物房IVC独立送风饲养系统中在SPF条件下分笼饲养，以国家标准啮齿类饲料喂养，自由饮食、饮水，温度范围21℃±2℃，相对湿度55%±5%。

1.2药品、主要试剂及仪器 穴位贴敷的药物由黄芪、党参、茯苓、甘草、白芥子、细辛、姜汁等组成(沈阳辽河大药房提供)，敷料为医用无纺布胶带(南昌市富达医疗器械有限公司)。D-半乳糖(美国Genview公司，批号5BN11010220)、氯化钠注射液(辽宁民康制药有限公司，批号H20054022)。Caspase-3试剂盒及Caspase-8试剂盒(天津市灏洋生物制品科技有限公司)。酶标仪〔赛默飞尔(上海)仪器有限公司〕，恒温水浴箱(河北黄骅航天仪器厂)。

1.3方法

1.3.1膏药制作方法与给药 于穴位贴敷当天，将黄芪、党参、茯苓、甘草、白芥子、细辛等药物按比例研成粉末，过200目筛，加适量姜汁调匀至糊状，制备成0.5 cm×0.5 cm大小的药块，用3 cm×3 cm大小的医用无纺布胶带固定于穴位贴敷组大鼠的双侧脾俞、双侧足三里穴位，再用一次性透气孔胶带缠绕一圈加以固定，对照组直接贴无纺布胶带于双侧脾俞、双侧足三里，每次贴敷6 h，持续4 w。

1.3.2动物分组与模型制备 将20只SD大鼠随机分为衰老模型组和穴位贴敷组(贴敷组)。参照文献〔4〕的方法，每个大鼠按125 mg·kg-1·d-1的剂量，进行D-半乳糖腹腔注射，共6 w。

1.3.3动物取材及指标检测 末次贴敷24 h后麻醉，取双侧股直肌，用酶联免疫吸附试验(ELISA)测量组织中Caspase-3和Caspase-8含量，测量过程严格按照试剂说明进行。

1.4统计学分析 采用SPSS17.0软件进行t检验。

2 结 果

贴敷组与衰老模型组Caspase-3和Caspase-8的表达差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 两组Caspase-3和Caspase-8的比较

3 讨 论

肌肉衰减综合征是随着年龄的增加出现的肌肉数量的减少及肌力的降低，主要表现为肌肉组织的萎缩、肌纤维束变窄、骨骼肌横截面积减小、肌肉力量减退、肌肉代谢能力下降和脂肪组织增多等特征。骨骼肌力量的衰退，可使老年人的活动能力和平衡能力减弱，易发生跌倒，甚至导致老年人长期卧床。对于个人家庭来讲，增加了老人自身的痛苦，也增加了其家人的经济及精力的负担。对于社会来讲，增加了社会的医疗保健成本。因此，有效干预老年人的肌肉衰减综合征的发生显得尤为重要。肌肉衰减综合征的病因病机复杂多样，包括活动量不足、营养缺乏、肌肉卫星细胞的数量减少和功能减退、蛋白质营养素的缺乏、骨骼肌线粒体功能紊乱、激素水平变化、基因与种族等因素相关，目前尚无较完备的理论。但有研究证实，衰老过程中线粒体介导的细胞凋亡信号通路在肌肉衰减综合征的发生与发展过程中发挥着重要的作用〔5〕。

中医学认为脾主运化、主统血、主四肢肌肉，是“气血生化之源”、“后天之本”。如果脾胃失健，便不能运化水谷精微至全身，就会出现肌肉萎缩、疲劳、肌耐力下降。从现代医学角度来讲，脾的功能与线粒体的功能在某种程度上是相似的，脾主肌肉亦是通过线粒体的功能来实现的〔6〕。线粒体是细胞中制造能量的结构，是细胞进行能量代谢的重要场所，具有“细胞的发电厂”之称。线粒体通过氧化磷酸化和三羧酸循环、氧化体内三大营养物质(糖、蛋白质、脂肪)生成腺苷三磷酸(ATP)，从而为细胞各项生命活动供应能量，也为肌肉收缩提供能量。这与中医中，脾能运化水谷精微、生化气血、润养肌肉的功能相一致。另一方面，线粒体迅速吸收Ca2+的能力使其成为细胞中Ca2+的缓冲区，线粒体可以储存Ca2+，控制细胞中Ca2+浓度的动态平衡，进而维持细胞的功能及肌肉的正常功能状态。线粒体这一功能也与中医学的“脾主肌肉”极其相似。有研究发现，长期脾虚模型大鼠的心肌、肝、胃黏膜和骨骼肌细胞线粒体含量减少，体积缩小或肿胀，线粒体结构遭到破坏，基质改变，而四君子汤复健组，其线粒体含量增加，结构恢复也接近正常〔7〕，其实验通过中医健脾的方法，达到了改善线粒体的效果，从实践上证实了脾与线粒体的相关性。

线粒体不仅是“细胞的发电厂”，而且在细胞凋亡的调控过程中起着重要的作用。根据目前的研究来看，线粒体参与细胞凋亡的途径大致有三条，第一条途径为线粒体通透性的改变，当线粒体通透性转变孔(MPTP)过度开放时，可以导致跨膜电位消失，线粒体呼吸链断裂，而且还会释放出天冬氨酸特异性的Caspase家族激活因子〔8〕，从而激活Caspase，启动细胞凋亡过程。Gao等〔9〕研究发现，MPTP持续开放时，出现了膜电位的降低，Caspase-3、-8、-9的活化，并且细胞凋亡增加。第二条途径为线粒体膜电位(MMP)的改变，当MMP下降时，可导致细胞的凋亡，而MMP的降低与MPTP的持续开放有关〔10〕，同时又可以进一步导致MPTP的过度开放。第三条途径线粒体膜磷脂的改变，心磷脂(CL)通过调节前凋亡因子从线粒体释放到细胞质，进而开启线粒体介导的细胞凋亡。Kagan等〔11〕的研究证实，在凋亡的过程中，CL的成分增加到了总量的40%。

在线粒体介导的细胞凋亡过程中，线粒体通透性的改变介导的Caspase依赖性细胞凋亡信号通路在肌肉衰减综合征的发生发展过程中起着重要的调节作用，而在对Caspase依赖性的凋亡过程中，Caspase-3和Caspase-8又起着比较关键的作用。一方面，在该通路中细胞色素C(cytC)与凋亡蛋白酶活化因子(Apaf)-1和Caspase前体蛋白(procaspase)-9可形成凋亡小体。当MPTP过度开放时，可导致cytC的释放，在脱氧腺苷三磷酸(dATP)存在的情况下，与Apaf-1和Procaspase-9相结合，形成凋亡小体，从而激活细胞凋亡启动因子Caspase-9，随后又激活细胞凋亡执行因子Caspase-3，继而使细胞走向不可逆的凋亡〔12，13〕。李海鹏等〔14〕研究显示，快速老化小鼠腓肠肌中Apaf-1和Caspase-3的表达均显著上调，这说明衰老促进了凋亡信号在骨骼肌中的表达，从而导致骨骼肌细胞凋亡及肌肉衰减综合征的发生。另一方面Caspase-8在Caspase级联反应中处于核心地位，几乎能激活所有凋亡级联反应下游的Caspase而诱发凋亡〔15〕。Caspase-8主要定位于线粒体，其可以自我活化，同时也可以在颗粒酶B的剪切下活化，而Caspase-8的激活不但可以启动细胞凋亡外途径，还可以启动细胞内途径来导致细胞凋亡。Caspase-8活化后能引发Caspase蛋白酶的解级联反应，然后进一步激活下游的Caspase-6、Caspase-7 等同源酶，最后激活其效应物Caspase-3，导致细胞凋亡〔16〕，使肌肉萎缩，肌力下降。同时，激活的Caspase-8能够裂解Bcl-2家族成员Bid，裂解产物的羧基端片段tBid转移到线粒体上，诱导线粒体cytC的释放〔17〕，最终激活细胞凋亡执行因子Caspase-3，导致细胞凋亡。因此，可以通过抑制Caspase-3和Caspase-8的表达来阻断骨骼肌细胞的凋亡，从而达到减缓肌肉衰减综合征的发生及发展的效果。同时，肌肉衰减综合征在中医学上属“痿证”范畴，其病因病机多为脾胃亏虚。那么从补益脾胃入手，观察中药贴敷后Caspase-3和Caspase-8的表达，以此来探讨穴位贴敷对肌肉衰减综合征的缓解是否有意义。