朱英杰 王慕鹏 竭 晶 宋 磊 彭丽萍

(吉林大学第一临床医学院，吉林 长春 130021)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是我国常见的慢性呼吸道疾病，据世界卫生组织(WHO)估计，至 2020年COPD可能上升为世界第三大致死病因，成为我国最大的疾病负担〔1〕。糖皮质激素(GC)作为目前临床上应用广泛且有效的抗炎症药物，在 COPD 治疗过程中发挥着举足轻重的作用。然而长期的激素治疗可能出现“糖皮质激素抵抗”现象，严重影响其治疗效果〔2〕。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是绿茶的一种主要多酚成分，绿茶的铁鳌和、抗氧化、抗炎、抗癌及神经保护等作用与 EGCG密切相关，而 EGCG对 COPD患者是否具有促进GC敏感性的作用及机制尚未见报道。本研究以小鼠肺泡上皮细胞系MLE12细胞为研究对象，探讨EGCG对烟草提取物(CSE)诱导的GC抵抗的作用及机制。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 清洁级C57/BL6小鼠由吉林大学基础医学院动物中心购置；脂多糖、Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒为日本同仁公司；组蛋白去乙酰化酶(HDAC)-2 抗体，美国Abcam公司；EGCG，长沙三福生物科技有限公司。

1.2CSE制备 使用前30 min 准备，将香烟点燃后，其过滤嘴一端连接橡皮管，橡皮管的另一端连接洗耳球。根据操作方式，提前测量洗耳球平均容量。准备一只空的密闭瓶，含有10 ml DMEM培养基，吸取约300 ml的烟雾注入瓶中，摇匀，使烟雾融入DMEM中，即为原液〔3〕。

1.3COPD小鼠模型的建立 参照文献〔4〕制作COPD小鼠模型。将脂多糖(LPS)配制成 1 mg/ml的溶液，4℃保存。造模开始第 1、14天将配制好的脂多糖溶液0.2 ml注入气道内，第2～13天、第15～28天，每日将小鼠放在60 cm×40 cm×50 cm的储物箱中被动吸烟，每次每笼小鼠1 h，5只小鼠/笼，2次/d，每次间隔4 h。将点燃的香烟放在鼠笼架上，让小鼠被动吸烟。COPD模型小鼠造模共28 d。

1.4小鼠肺泡灌洗液(BALF)的分离 COPD小鼠模型造模成功后，按照参考文献〔4〕，取得COPD小鼠模型BALF，1 500 r/min离心10 min，细胞沉淀用磷酸盐缓冲液(PBS)重悬，将重悬液分为对照组、CSE组、地塞米松(Dex)+CSE组、EGCG+CSE组、EGCG I+Dex+CSE组、EGCG Ⅱ+Dex+CSE组和EGCG Ⅲ+Dex+CSE组，使用实时定量PCR(RT-PCR)分别测定重悬细胞总数、巨噬细胞数和中性粒细胞数。

1.5EGCG对MLE12细胞活性影响的测定 分别使用5、10、50、100 μl EGCG刺激MLE12细胞，使用CCK-8试剂盒测定细胞活性(按照说明书操作)。

1.6MEL12细胞炎性因子mRNA测定 用LPS(500 ng/ml)处理18 h，用Trizol试剂分离细胞总RNA，按照说明书操作。分光光度计测定RNA的浓度，通过Prime-Script RT-PCR将1 μg RNA转化成cDNA。RT-PCR在0.2 ml PCR管中进行，SYBR green染色剂，使用定制PCR主混合物95℃10 min，接着40个循环的95℃10 s，60℃ 30 s。用GAPDH标准化分析相对基因表达mRNA表达。

1.7MLE12细胞上清炎症因子的测定 收集对照组、CSE组、Dex+CSE组、EGCG+CSE组、EGCG Ⅰ+Dex+CSE组、EGCG Ⅱ+Dex+CSE组和EGCG Ⅲ+Dex+CSE组细胞上清，使用酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒测定炎症因子白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达量。

1.8Western印迹测定MLE12细胞中HACD-2蛋白表达量 将MLE12细胞分为对照组、CSE组、EGCG Ⅰ+CSE组、EGCG Ⅱ+CSE组和EGCG Ⅲ+CSE组，用HDAC-2抗体，采用Western印迹方法测定五组MLE12细胞中HDAC-2蛋白的表达。

1.9统计学方法 应用SPSS17.0 软件，多组间显著性检验采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。

2 结 果

2.1EGCG对MLE12细胞活性的影响 与对照组(设为1)相比，5、10、50、100 μmol/L EGCG刺激MLE12细胞，对细胞的活性并无影响(分别为1.07±0.19，0.92±0.20，1.04±0.21，0.95±0.22，均P>0.05)。

2.2EGCG减轻CSE诱导的炎症反应 EGCG Ⅱ+Dex+CSE组和EGCG Ⅲ+Dex+CSE组MLE12细胞中及细胞上清中IL-1β、IL-6、TNF-α的表达量显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.3EGCG对COPD模型小鼠呼吸道中的炎症反应的影响 使用25 μl和100 μl EGCG与CSE同时作用BALF重悬细胞中细胞数明显降低、巨噬细胞明显升高、中性粒细胞明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2，表3。

表1 各组BALF细胞总数、巨噬细胞、中性粒细胞水平比较

与其余5组比较：1)P<0.01

表2 各组IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白水平比较

与其余5组比较：1)P<0.05,2)P<0.01

表3 各组IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA水平比较

与其余5组比较：1)P<0.05，2)P<0.01

2.4EGCG促进HDAC-2的活性 50 μl和100 μl EGCG与CSE同时作用于MLE12细胞，HDAC蛋白表达量显著增加，而磷酸化HDAC-2(p-HDAC-2)蛋白表达量显著下降，差异有统计学意义(均P<0.01)。见图1，表4。

图1 Western印迹测定HDAC-2及p-HDAC-2蛋白表达量

组别HDAC-2p-HDAC-2对照组1±0.261±0.17CSE组0.29±0.083.46±0.49CSE+EGCG Ⅰ组0.35±0.062.74±0.51CSE+EGCG Ⅱ组0.89±0.241)1.38±0.221)CSE+EGCG Ⅲ组1.17±0.311)1.34±0.271)

与其余3组比较：1)P<0.01

3 讨 论

COPD是外界环境因素和宿主因素交互作用的结果，主要特征是持续气流受限，且不完全可逆。气道炎症是COPD主要发病机制，由吸烟引起的慢性氧化应激也在COPD发病中起重要作用，GC作为目前临床上应用广泛的抗炎症药物，是治疗COPD的重要药物之一〔5〕，在 COPD 治疗中发挥着举足轻重的作用。然而临床上COPD患者对GC的敏感性远不如支气管哮喘，沙特胸科协会的最新一项调查显示，只有55%的被调查者认为吸入GC能有效改善COPD患者的生活质量〔6〕。长期的激素治疗，可能出现所谓的“GC抵抗”现象，增加了激素副作用的发生。GC抵抗的相关机制包括HDAC-2活性下降、GC受体异常、核因子(NF)-κB激活通路缺乏等〔7〕。本研究发现，COPD小鼠氧化应激反应模型中炎症反应增强，而HDAC-2蛋白表达降低，推测COPD患者的GC抵抗与HDAC-2活性降低有一定的联系，但具体调控通路，本课题组还需进一步验证。

近年来，中药单体对COPD的调节作用及机制的研究日渐增多，可通过多途径、多环节调节，如黄芩苷通过抑制IL-1β、IL-8、IL-6和TNF-α等抑制COPD的炎症反应；穿心莲内酯很可能通过上调Nrf-2活性增加抗氧化基因表达从而对COPD有抑制作用〔8〕；姜黄素通过维持HDAC-2含量恢复GC类敏感性，从而可作为GC类联合用药治疗COPD。EGCG是绿茶的一种主要多酚成分，通过增强抗氧化途径抑制小鼠的狼疮性肾炎；抑制人支气管上皮细胞中烟草诱导的NF-κB激活；通过Nrf-2-Keap1通路增强抗氧化活性，抑制肺纤维化中的炎症反应，但EGCG是否可通过抗氧化进而增加COPD病人对GC的敏感性还不清楚。本研究发现，EGCG可显著抑制烟草诱导产生的氧化应激，如抑制炎症反应，增加COPD模型鼠中巨噬细胞量，降低中性粒细胞含量，并上调MLE12中HDAC-2含量，发挥抗炎和抗氧化作用。这为进一步研究其抗氧化作用机制及恢复COPD病人对GC类药物敏感性奠定了基础。