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表没食子儿荣素没食子酸酯对慢性阻塞性肺疾病模型小鼠糖皮质激素敏感性的影响

2018-08-15朱英杰王慕鹏彭丽萍

中国老年学杂志 2018年15期
关键词:敏感性抗氧化小鼠

朱英杰 王慕鹏 竭 晶 宋 磊 彭丽萍

(吉林大学第一临床医学院,吉林 长春 130021)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是我国常见的慢性呼吸道疾病,据世界卫生组织(WHO)估计,至 2020年COPD可能上升为世界第三大致死病因,成为我国最大的疾病负担〔1〕。糖皮质激素(GC)作为目前临床上应用广泛且有效的抗炎症药物,在 COPD 治疗过程中发挥着举足轻重的作用。然而长期的激素治疗可能出现“糖皮质激素抵抗”现象,严重影响其治疗效果〔2〕。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是绿茶的一种主要多酚成分,绿茶的铁鳌和、抗氧化、抗炎、抗癌及神经保护等作用与 EGCG密切相关,而 EGCG对 COPD患者是否具有促进GC敏感性的作用及机制尚未见报道。本研究以小鼠肺泡上皮细胞系MLE12细胞为研究对象,探讨EGCG对烟草提取物(CSE)诱导的GC抵抗的作用及机制。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 清洁级C57/BL6小鼠由吉林大学基础医学院动物中心购置;脂多糖、Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒为日本同仁公司;组蛋白去乙酰化酶(HDAC)-2 抗体,美国Abcam公司;EGCG,长沙三福生物科技有限公司。

1.2CSE制备 使用前30 min 准备,将香烟点燃后,其过滤嘴一端连接橡皮管,橡皮管的另一端连接洗耳球。根据操作方式,提前测量洗耳球平均容量。准备一只空的密闭瓶,含有10 ml DMEM培养基,吸取约300 ml的烟雾注入瓶中,摇匀,使烟雾融入DMEM中,即为原液〔3〕。

1.3COPD小鼠模型的建立 参照文献〔4〕制作COPD小鼠模型。将脂多糖(LPS)配制成 1 mg/ml的溶液,4℃保存。造模开始第 1、14天将配制好的脂多糖溶液0.2 ml注入气道内,第2~13天、第15~28天,每日将小鼠放在60 cm×40 cm×50 cm的储物箱中被动吸烟,每次每笼小鼠1 h,5只小鼠/笼,2次/d,每次间隔4 h。将点燃的香烟放在鼠笼架上,让小鼠被动吸烟。COPD模型小鼠造模共28 d。

1.4小鼠肺泡灌洗液(BALF)的分离 COPD小鼠模型造模成功后,按照参考文献〔4〕,取得COPD小鼠模型BALF,1 500 r/min离心10 min,细胞沉淀用磷酸盐缓冲液(PBS)重悬,将重悬液分为对照组、CSE组、地塞米松(Dex)+CSE组、EGCG+CSE组、EGCG I+Dex+CSE组、EGCG Ⅱ+Dex+CSE组和EGCG Ⅲ+Dex+CSE组,使用实时定量PCR(RT-PCR)分别测定重悬细胞总数、巨噬细胞数和中性粒细胞数。

1.5EGCG对MLE12细胞活性影响的测定 分别使用5、10、50、100 μl EGCG刺激MLE12细胞,使用CCK-8试剂盒测定细胞活性(按照说明书操作)。

1.6MEL12细胞炎性因子mRNA测定 用LPS(500 ng/ml)处理18 h,用Trizol试剂分离细胞总RNA,按照说明书操作。分光光度计测定RNA的浓度,通过Prime-Script RT-PCR将1 μg RNA转化成cDNA。RT-PCR在0.2 ml PCR管中进行,SYBR green染色剂,使用定制PCR主混合物95℃10 min,接着40个循环的95℃10 s,60℃ 30 s。用GAPDH标准化分析相对基因表达mRNA表达。

1.7MLE12细胞上清炎症因子的测定 收集对照组、CSE组、Dex+CSE组、EGCG+CSE组、EGCG Ⅰ+Dex+CSE组、EGCG Ⅱ+Dex+CSE组和EGCG Ⅲ+Dex+CSE组细胞上清,使用酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒测定炎症因子白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达量。

1.8Western印迹测定MLE12细胞中HACD-2蛋白表达量 将MLE12细胞分为对照组、CSE组、EGCG Ⅰ+CSE组、EGCG Ⅱ+CSE组和EGCG Ⅲ+CSE组,用HDAC-2抗体,采用Western印迹方法测定五组MLE12细胞中HDAC-2蛋白的表达。

1.9统计学方法 应用SPSS17.0 软件,多组间显著性检验采用单因素方差分析,两两比较采用LSD法。

2 结 果

2.1EGCG对MLE12细胞活性的影响 与对照组(设为1)相比,5、10、50、100 μmol/L EGCG刺激MLE12细胞,对细胞的活性并无影响(分别为1.07±0.19,0.92±0.20,1.04±0.21,0.95±0.22,均P>0.05)。

2.2EGCG减轻CSE诱导的炎症反应 EGCG Ⅱ+Dex+CSE组和EGCG Ⅲ+Dex+CSE组MLE12细胞中及细胞上清中IL-1β、IL-6、TNF-α的表达量显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.3EGCG对COPD模型小鼠呼吸道中的炎症反应的影响 使用25 μl和100 μl EGCG与CSE同时作用BALF重悬细胞中细胞数明显降低、巨噬细胞明显升高、中性粒细胞明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。见表2,表3。

表1 各组BALF细胞总数、巨噬细胞、中性粒细胞水平比较

与其余5组比较:1)P<0.01

表2 各组IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白水平比较

与其余5组比较:1)P<0.05,2)P<0.01

表3 各组IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA水平比较

与其余5组比较:1)P<0.05,2)P<0.01

2.4EGCG促进HDAC-2的活性 50 μl和100 μl EGCG与CSE同时作用于MLE12细胞,HDAC蛋白表达量显著增加,而磷酸化HDAC-2(p-HDAC-2)蛋白表达量显著下降,差异有统计学意义(均P<0.01)。见图1,表4。

图1 Western印迹测定HDAC-2及p-HDAC-2蛋白表达量

组别HDAC-2p-HDAC-2对照组1±0.261±0.17CSE组0.29±0.083.46±0.49CSE+EGCG Ⅰ组0.35±0.062.74±0.51CSE+EGCG Ⅱ组0.89±0.241)1.38±0.221)CSE+EGCG Ⅲ组1.17±0.311)1.34±0.271)

与其余3组比较:1)P<0.01

3 讨 论

COPD是外界环境因素和宿主因素交互作用的结果,主要特征是持续气流受限,且不完全可逆。气道炎症是COPD主要发病机制,由吸烟引起的慢性氧化应激也在COPD发病中起重要作用,GC作为目前临床上应用广泛的抗炎症药物,是治疗COPD的重要药物之一〔5〕,在 COPD 治疗中发挥着举足轻重的作用。然而临床上COPD患者对GC的敏感性远不如支气管哮喘,沙特胸科协会的最新一项调查显示,只有55%的被调查者认为吸入GC能有效改善COPD患者的生活质量〔6〕。长期的激素治疗,可能出现所谓的“GC抵抗”现象,增加了激素副作用的发生。GC抵抗的相关机制包括HDAC-2活性下降、GC受体异常、核因子(NF)-κB激活通路缺乏等〔7〕。本研究发现,COPD小鼠氧化应激反应模型中炎症反应增强,而HDAC-2蛋白表达降低,推测COPD患者的GC抵抗与HDAC-2活性降低有一定的联系,但具体调控通路,本课题组还需进一步验证。

近年来,中药单体对COPD的调节作用及机制的研究日渐增多,可通过多途径、多环节调节,如黄芩苷通过抑制IL-1β、IL-8、IL-6和TNF-α等抑制COPD的炎症反应;穿心莲内酯很可能通过上调Nrf-2活性增加抗氧化基因表达从而对COPD有抑制作用〔8〕;姜黄素通过维持HDAC-2含量恢复GC类敏感性,从而可作为GC类联合用药治疗COPD。EGCG是绿茶的一种主要多酚成分,通过增强抗氧化途径抑制小鼠的狼疮性肾炎;抑制人支气管上皮细胞中烟草诱导的NF-κB激活;通过Nrf-2-Keap1通路增强抗氧化活性,抑制肺纤维化中的炎症反应,但EGCG是否可通过抗氧化进而增加COPD病人对GC的敏感性还不清楚。本研究发现,EGCG可显著抑制烟草诱导产生的氧化应激,如抑制炎症反应,增加COPD模型鼠中巨噬细胞量,降低中性粒细胞含量,并上调MLE12中HDAC-2含量,发挥抗炎和抗氧化作用。这为进一步研究其抗氧化作用机制及恢复COPD病人对GC类药物敏感性奠定了基础。

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