杨 宇 曲义坤 丁 隆 赵 勇 李艳君 陈立强 孙 权

(佳木斯大学基础医学院局部解剖学教研室，黑龙江 佳木斯 154007)

感染是肝移植术后最常见的并发症,亦是移植病人术后死亡的主要原因之一，包括病毒、细菌、真菌的感染。然而，在肝移植受者中大部分严重感染源自腹腔内细菌或真菌感染，而且发生率高，为35%～70%，半数患者感染发生在移植术后2 w内。在临床实际治疗中，发生细菌感染的病人，免疫抑制药物的应用与抗感染治疗产生了矛盾，这时为抢救病人的生命，往往需要减量或停用免疫抑制药物，而这对移植肝脏的影响尚不得而知。研究〔1〕指出，当发生重症感染时，机体为保护组织器官的过度病理性损害，激发免疫反应的同时，也可能启动了免疫抑制效应。在众多因素中，CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)的表达变化引起了广泛关注，它能够分泌免疫抑制因子白细胞介素(IL)-10和肿瘤坏死因子(TGF)-β，并通过这两种细胞因子发挥较强的免疫抑制效应；而且Treg细胞能够抑制免疫排斥反应和移植物抗宿主病(GVHD)的发生。可见感染和免疫排斥反应诱导了Treg细胞的增殖和Th细胞分化，然而并不是所有增殖的Treg都能表达调节性T细胞转录调节因子(Foxp)3基因，因此通过给予不同的单克隆抗体，可以验证在这种免疫紊乱中Treg是否发挥了免疫学效应，本研究探讨Treg在大鼠肝移植术后感染免疫紊乱中的作用。

1 资料与方法

1.1实验分组 以DA大鼠为供体，LEW大鼠为受体，术后分为4组，每组30只：急性排斥(G1)组、移植后腹腔感染(G2)组、在G2组处理的基础上于术后第2天始加用anti-IL-10和anti-TGF-β单克隆抗体(G3)组，注射量分别为：1.2 mg·kg-1·d-1和0.9 mg·kg-1·d-1，G4组：在G3组处理的基础上于术后第2天开始加用anti-CD25单克隆抗体，注射量为1.0 mg·kg-1·d-1。每组设感染前1 d、感染后1、3、5、7 d 5 个时相点，每个时相点6 只大鼠。

1.2检测指标 分别采用流式细胞术、单向混合淋巴细胞培养、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术测定外周血淋巴细胞亚群、淋巴细胞功能、肝脏内IL-4、干扰素(IFN)-γ、IL-10、TGF-β mRNA。

1.3统计学方法 应用SAS6.0软件进行方差分析、t检验、Kaplan-Meier曲线及对数秩检验(Log-Rank)。

2 结 果

2.1大鼠生存状态观察 G1组术后精神状态尚可，6 d后出现巩膜黄染，体重逐渐下降，食欲活动均下降，多于术后13 d左右死亡。G2组感染后5 d部分出现少量口鼻出血，嗜睡状态，并有死亡鼠，感染后7 d生存率为37.5%，最长生存8 d。G3、G4组感染后巩膜渐进性黄染，口鼻、眼角不同程度出血，体重下降，体温升高，活动减少，生存时间缩短，感染后7 d生存率为只有25%。

2.2外周血淋巴细胞亚群(CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)的变化 各组淋巴细胞亚群数量在感染后不断下降。在感染后5 d CD4+、CD8+在G3、G4组的数量与G1、G2组比较差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)；感染后CD4+/CD8+比值回升，在G3组感染后5 d CD4+/CD8+比值变化显著，与G1、G4组差异均有统计学意义(P<0.01)，G4组CD4+/CD8+比值回升虽不及G3组显著，但在感染后3 d各时间点与G2、G1组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.3外周血淋巴细胞功能的改变 随术后(感染后)时间的增长，各组淋巴细胞功能持续上升。G3组升高更显著，G3、G4组在感染后3、5、7 d与G1组相比差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。G3与G4组仅在感染后3 d和7 d比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.4各组肝内IL-4、IFN-γ、IL-10、TGF-β mRNA的表达水平 G2、G3、G4组IL-4 mRNA表达水平持续上升(P<0.05)，与G2组比较，G3、G4组的表达水平自感染后各时间点差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)，见表3。G1、G3、G4组IFN-γ mRNA的表达水平均逐渐增加(P<0.05)，G3组变化显著。G3、G4组自感染后各时间点与G2组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。见表4。IL-10、TGF-β mRNA表达含量在G3组的表达水平极低，与各组比较差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)；在G4组表达持续下降，术后各时间点与其他三组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。G1、G3、G4组随着术后(感染后)时间增长，IL-10、TGF-β mRNA表达逐渐下降，G2组逐渐升高，见表5，表6。

表1 各组术后(感染后)不同时间点淋巴细胞亚群变化

与前一时间点比较：1)P<0.01；与G1组比较：2)P<0.01；与G2组比较：3)P<0.05；与G3组比较：4)P<0.05

表2 各组术后(感染后)不同时间点淋巴细胞功能的变化

与前一时间点相比：1)P<0.05；与G1组相比：2)P<0.05,3)P<0.01；与G3组比较：4)P<0.05；表3同

表3 各组术后(感染后)不同时间点肝脏内IL-4 mRNA表达含量的变化

表4 各组术后(感染后)不同时间点肝脏IFN-γ mRNA的表达水平变化

与前一时间点比较：1)P<0.05；与G2组比较：2)P<0.01

表5 各组术后(感染后)不同时间点肝脏内IL-10 mRNA表达含量的变化

与G3组比较：1)P<0.05,2)P<0.01；与G4组比较：3)P<0.01；与前一时间点比较：4)P<0.05,5)P<0.01，表6同

表6 各组术后(感染后)不同时间点肝脏TGF-β mRNA的表达水平变化

3 讨 论

感染性疾病往往伴随着炎症及组织损伤，因此抗原提呈细胞(APC)递呈的抗原不仅有病原体抗原，也有自身抗原，机体为调节这种免疫效应，在激活效应T细胞的同时也激活了Treg，防止过度的组织损伤。CD4+CD25+T细胞的激活虽然对机体起到了一定的保护作用，但同时也抑制了机体对病原微生物的清除，致使慢性炎症发生，严重的还可能引发致命性的感染。Stoop等〔2〕研究指出，感染单纯疱疹病毒的小鼠体内可以分离到大量的CD4+CD25+T细胞，用anti-CD25抗体拮抗CD25分子，则可提高机体的抗病毒能力。类似的结果在对慢性乙型或丙型肝炎病人的研究中也得到证实，并且通过体外实验研究表明，CD4+CD25+T细胞明显抑制了抗病毒的特异性效应T细胞的功能〔3～6〕。Belkaid等〔7,8〕研究小鼠真皮利什曼原虫感染时发现，在感染部位，CD4+T细胞和CD4+CD25+T细胞均有增殖。体外的实验〔8〕结果证实，CD4+CD25+T细胞借助于IL-10发挥抑制效应，若用anti-CD25抗体预处理则可提高机体对利什曼原虫的清除。

本研究说明抗体的应用阻抗了Treg细胞对淋巴细胞功能的抑制作用，而anti-IL-10/TGF-β单克隆抗体能更有效地阻止已发生的免疫抑制作用。

Treg不仅能诱导移植免疫耐受，同时也能阻止GVHD的发生。Cohen等〔8〕在研究Treg在造血干细胞移植中作用时发现，少量(3%～5%)的Treg即能抑制GVHD的发生，如果将这部分Treg剔除，则加速了疾病的发生；相反，若输注新鲜分离的Treg则可延缓GVHD的发生。Johnson等〔9〕、Hoffman等〔10〕也通过不同的实验方法直接或间接证明了Treg在抑制GVHD中发挥了重要作用。

从本研究结果看出，抑制Treg的增殖部分恢复了肝移植术后细菌感染引起的免疫抑制作用；而应用anti-IL-10/TGF-β单克隆抗体其作用高于应用anti-CD25单克隆抗体的原因，分析为：Treg虽然依赖于IL-10和TGF-β发挥作用，但Treg不是唯一能分泌IL-10和TGF-β的细胞，内皮细胞、巨噬细胞、Th2细胞具有同样的作用；而本研究结果也发现，抑制Treg促进了Th2细胞的分化，大鼠体内IL-10 mRNA的表达虽然下降，但并没有完全被阻遏，而这部分因子尚能发挥免疫抑制作用。

综上，抑制Treg的增殖部分恢复了淋巴细胞的功能；抑制Treg的增殖，减少了体内IL-10和TGF-β mRNA的表达水平；Th细胞的分化不是Treg作用的结果，但后者可以部分地抑制前者的分化。