张 新 赵 燕 魏 玲

(河北医科大学第一医院眼科，河北 石家庄 050031)

青光眼致盲率位居眼科疾病的第二位，仅次于白内障〔1〕。老年性青光眼在老年人中极其常见，且随增龄发病率增高〔2〕。青光眼的发病与多种因素有关，其中视网膜小胶质细胞扮演着重要的角色。小胶质细胞在青光眼发病早期出现增殖和阿米巴样变化，同时伴随大量的前炎症因子如肿瘤坏死因子(TNF)-α及白细胞介素(IL)-1β增加，这些炎症因子会进一步诱发视网膜的损害〔3，4〕。目前治疗青光眼主要通过手术及降压药对症治疗，虽然眼内压降低，但视力功能仍然发生进一步的损害，加强手术后对视网膜细胞的保护能够有效缓解疾病。决明子具有清肝明目、润肠通便的作用。现代药理学研究证实了决明子具有多种作用，包括降血脂、降血压、抗氧化等，已广泛应用于医药、饮食保健等多个领域〔5～7〕。决明子多糖是决明子的主要有效成分之一。本实验拟探讨决明子多糖对青光眼大鼠视网膜病变及视网膜细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1动物与细胞 BV2小胶质细胞，购于国家实验细胞共享平台。SD大鼠，雌雄各半，SPF级，60只，体质量230～270 g。购自河北省实验动物中心，许可证号为 SCXK(冀) 2009-0022。光照和黑暗时间各12 h，湿度50%～70%，自由饮食和饮水。

1.2主要试剂与仪器 胰蛋白酶(Gibco)；胎牛血清(Hyclone)；DMEM(Hyclone)；青链双抗(Hyclone)；脂多糖(LPS，Sigma)；DMSO(碧云天)；氯仿(北京化工厂)；异丙醇(北京化工厂)；逆转录及Q-PCR试剂盒(宝生物工程公司)；Trizol Reagent(Life technology)；TUNEL试剂盒(Promega)；二氧化碳培养箱(Thermo Scientific)；倒置显微镜(Olympus)；超纯水机(Millipore)；酶标仪(Thermo)；荧光定量PCR仪(伯乐)；高速低温离心机(Eppendorf)；万分之一天平(梅特勒)。

1.3药物配置 决明子多糖购于兰州沃特莱斯生物科技有限公司。细胞实验：决明子多糖使用含10%FBS的DMEM高糖培养液配置成2 g/L的母液，使用时配置成15，30和60 mg/L的工作液。动物实验，决明子多糖使用蒸馏水配置成25，50和100 mg/ml，按照2 ml/100 g体重灌胃大鼠。

1.4小胶质细胞培养 使用含有10%FBS的DMEM高糖培养基进行BV2小胶质细胞的培养，另外添加1%的青链双抗以防止细胞污染。细胞复苏时取出冻存的BV2细胞，于37℃条件下迅速解冻后接种于3.5 mm培养皿，培养36 h。待细胞基本长满培养皿后，使用0.25%胰蛋白酶消化细胞，150 g，3 min离心收集细胞，新鲜培养液重悬后传代。冻存细胞使用含有15%DMSO的细胞培养液，如上述使用胰蛋白酶消化细胞离心收集后，使用冻存细胞液重悬BV2细胞，并置于梯度冻存盒内，24 h后转移至液氮中冻存。

1.5小胶质细胞阿米巴原化实验 体外培养BV2小胶质细胞，分为对照组，LPS组，决明子多糖低、中和高剂量组，每组6孔于96孔板内进行实验。决明子多糖低、中和高剂量组分别加入不同浓度的决明子多糖，使其终浓度分别为15，30和60 mg/L，共孵育12 h。孵育完成后，除对照组外，其余各组均加入LPS使其终浓度为1 mg/L。孵育12 h后使用冷丙酮固定，送本院病理科使用苏木精染色。倒置显微镜观察细胞阿米巴样变化，6个样品孔，每孔计数50个细胞，记录阿米巴原化的细胞数量。

1.6小胶质细胞TNF-α及IL-1β基因表达实验 如1.5所述分别加入决明子多糖及LPS刺激细胞，孵育完成后使用PBS冲洗细胞，并加入Trizol裂解细胞，按照Trizol试剂盒说明书方法提取RNA。使用宝生物逆转录试剂盒逆转录成cDNA，使用仪器自带程序按2-△△Ct法计算TNF-α及IL-1β基因表达量。TNF-α引物为5′-GAAAGCAAGCAGCCAACCA-3′及5′-CGGATCATGCTTTCTGTGCTC-3′。IL-1β引物为5′-AATGACCTGTTCTTTGAAGTTGA-3′及5′-TGATGTGCTGCTGCG AGATTTGAAG-3′；GAPDH内参基因为5′-TTAGCACCCCTGGCCAAGG-3′及5′-CTTACTCCTTGGAGGCCAT G-3′。扩增条件为95℃，30 s，1个循环;95℃，5 s，60℃，35 s，40个循环。

1.7青光眼大鼠造模 60只SD雄性大鼠，随机分为对照组，模型组，决明子多糖低、中和高剂量组(500，1 000和2 000 mg/kg)，每组12只。 除对照组外，其余48只大鼠使用手术法造青光眼模型。大鼠使用10%水合氯醛麻醉后开眼睑，使用精细剪剪开球结膜，暴露上直肌、下直肌，使用体视显微镜找到巩膜上静脉，并使用烙铁针烙断3条巩膜上静脉，以远端上静脉变白作为烙闭成功的指标。手术3 d后开始灌胃给药，决明子多糖组给予相应剂量的决明子多糖，对照和模型组给予等量蒸馏水，共灌胃3 w。

1.8大鼠眼内压测定 于术后第3日及3 w灌胃完成后上午8～10点测定大鼠眼内压变化。大鼠使用奥布卡因滴眼液麻醉，并使用Goldmann鼠用眼压测定仪测定大鼠左眼眼内压。每只测定3次取均值。

1.9大鼠视网膜TUNEL及HE染色 灌胃给药3 w后，大鼠使用乙醚过量麻醉处死，迅速分离大鼠左右眼，使用PBS溶液冲洗后，沿角膜剪开去除晶状体及玻璃体，操作轻柔避免损伤视网膜。将剩余部分全部放入4%多聚甲醛中固定，送检本院病理科制作切片，其中左眼于病理科HE染色并观察视网膜组织结构变化，右眼切片TUNEL染色观察细胞凋亡情况。

1.10统计学分析 采用SPSS21.0软件，多组比较采用LSD法。

2 结 果

2.1决明子多糖对小胶质细胞阿米巴原化的影响 如图1所示，LPS组BV2小胶质细胞出现明显的阿米巴原化。对照组、LPS组、决明子多糖低、中和高剂量组的BV2小胶质细胞阿米巴原化率分别为(0.0±0.0)%，(72.8±4.3)%，(51.2±6.5)%，(37.22±3.7)%，(23.9±2.8)%。与LPS组细胞阿米巴原化率相比，决明子多糖低(P<0.05)、中(P<0.01)和高剂量组BV2小胶质细胞阿米巴原化率明显降低(P<0.01)，差异有统计学意义。

图1 小胶质细胞阿米巴样变化(HE，×400)

2.2决明子多糖对小胶质细胞TNF-α和IL-1β基因表达的影响 与对照组相比，LPS组TNF-α和IL-1β基因表达水平显著上调(P<0.05或P<0.01)。与LPS组比较，决明子多糖低、中和高剂量组的TNF-α基因表达水平显著性下调(P<0.05或P<0.01)；决明子多糖高剂量组的IL-1β水平显著性下调(P<0.05)。见表1。

2.3决明子多糖对青光眼大鼠眼内压的影响 与对照组相比，模型组在造模3 d后及给药3 w后左眼眼内压显著性升高(P<0.01)。与模型组相比，决明子多糖低、中和高剂量组在造模3 d后及给药3 w后左眼眼内压均无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1 各组TNF-α和IL-1β的基因表达

与对照组比较：1)P<0.01，2)P<0.05；与LPS组比较：3)P<0.01，4)P<0.05；表2同

表2 各组大鼠眼内压

2.4决明子多糖对青光眼大鼠视网膜细胞凋亡的影响 与对照组〔(0.0±0.0)个〕相比，模型组视网膜凋亡细胞个数显著性增加〔(11.2±1.5)个，P<0.01〕。与模型组大鼠相比，决明子多糖低、中和高剂量组视网膜凋亡细胞个数显著性减少〔分别为(8.8±1.0)个，(8.3±1.6)个，(6.5±1.3)个；P<0.05〕。

2.5决明子多糖对青光眼大鼠视网膜组织结构的影响 对照组视网膜结构清晰，视网膜细胞排列整齐，可见细胞呈现三层分布。模型组视网膜结构混乱，视网膜神经节细胞层和内核层交错混杂。决明子多糖低剂量组可见视网膜神经节细胞层及内核层，但神经节细胞层有损伤。决明子中剂量组及高剂量组神经节细胞层均未见明显损伤。见图2。

图2 各组大鼠视网膜组织结构图(×200)

3 讨 论

小胶质细胞是介导神经系统免疫应答的效应细胞，在对抗感染等应激性疾病的过程中起着重要的作用〔8〕。在正常状态下，小胶质细胞可以及时清理机体内衰老或坏死的神经细胞。而在应激状态下，如青光眼或感染状态，小胶质细胞会迅速分化，发生阿米巴样改变，成为免疫效应细胞。在应激状态早期，小胶质细胞分泌的前炎症因子如TNF-α和IL-1β等能够有效保护视网膜细胞。但随着病程延长，小胶质细胞引起的炎症会损伤正常的视网膜神经细胞，从而加剧损伤〔9〕。决明子是豆科植物决明的干燥种子，以其清肝明目的作用而命名。《本草纲目》记载，决明子能够除肝胆风热，淫肤白膜，青盲。现代药理学研究亦证实了决明子具有明目的功效〔10〕。本实验首次从体外及体内两个方面探讨了决明子多糖对大鼠青光眼视网膜细胞的保护作用。证实了决明子能够通过抑制小胶质细胞阿米巴样变化，从而抑制其炎症因子的产生，起到保护青光眼大鼠视网膜细胞的作用。而在体实验说明，决明子多糖保护视网膜细胞的作用与抑制视网膜细胞凋亡有关，但其直接降低眼内压的作用并不明显。大鼠眼内压测定的误差较大，本实验采用同一大鼠测定3次的方法减小误差以获得准确的数据。