李鑫辉 黄政德 黄淼鑫 杜建芳 李雅婧 许福丽 肖 青 郭晨鹤 徐玛丽

(湖南中医药大学，湖南 长沙 410208)

心肌缺血再灌注损伤(IRI)是目前治疗心肌缺血及预后所面临的主要难题之一，如何有效预防和治疗心肌IRI是近年临床和科研的研究热点，有研究证明凋亡在IRI中起主导作用〔1〕。目前运用干细胞技术治疗IRI研究主要包括干细胞移植技术和干细胞动员技术〔2〕，前者繁琐，需要分离培养、移植等，而经动员后的骨髓干细胞可自行归巢于缺血区，并分化为内皮细胞及心肌细胞，相对简单，无创伤性，因而受到关注。有研究表明中药可以影响干细胞的动员、归巢，对干细胞治疗缺血性心肌病起到优势互补、协同增效的作用〔3,4〕。本研究探讨益气活血方动员骨髓干细胞对心肌IRI大鼠JAK2-PI3K信号转导调节的动态影响。

1 材料与方法

1.1动物、主要试剂及仪器 SD大鼠144只，体重200～250 g。由湖南中医药大学实验动物中心提供，许可证号为SCXK(湘)2009-0001。JAK2，一抗，武汉博士德公司；PI3K，一抗，武汉博士德公司；多道生理信号采集处理系统，RM-6280型，成都仪器厂制造；岛津分光光度计，UV-1700 PharmaSpec型，Japan；显微摄像系统，Motic B5型，麦克奥迪实业集团公司；益气活血方药(红花5 g，生地15 g，黄芪25 g，丹参20 g，檀香5 g，赤芍10 g，川芎10 g，当归10 g等)，由湖南中医药大学第一附属医院药房提供并经过浸泡，去渣，水煎浓缩至药液浓度1 g/ml(含生药)，保存备用。

1.2方法

1.2.1造模方法 大鼠用10%水合氯醛麻醉后开胸，找到位于左心耳和肺动脉圆锥间与左冠状动脉伴行的冠状静脉，并以此静脉为标志进行结扎当心电图呈现ST段、T波进行性抬高，为心肌缺血的标志。以ST段下移，缺血部位心肌颜色恢复为血流再灌注成功。

1.2.2动物分组及给药方法 大鼠144只随机分组，于造模后3个不同时间段观察，A：假手术组；B：IRI组；C：重组人促红细胞生成素(rhEPO)动员组；D:益气活血方组；E:益气活血方联合动员组;F:LY294002组(益气活血方联合动员+PI3K的特异性阻断剂组)，每组8只。A组只穿线不结扎，其余各组行IRI手术，结扎冠脉30 min后恢复血流；C、E和F组在腹腔注射rhEPO(2 000 U/kg)，每天1次，连续3 d(即造模前1 d、造模当天、造模后1 d)，A、B和D组注射等剂量生理盐水；F组在结扎前30 min，尾静脉注射PI3K的阻断剂LY294002(0.3 mg/kg)。按人(60 kg)与动物体表面积折算剂量给药，D、E和F组，灌胃益气活血方药10 ml·kg-1·d-1〔相当于生药含量10 g·kg-1·d-1〕5 d(即造模前2 d、造模后3 d)，每天1次；A、B和C组灌胃等量0.9%NaCl溶液5 d，每天1次。

1.2.3心肌细胞JAK2、PI3K蛋白表达测定 在造模型后7 d，14 d，28 d将动物处死，取各组缺血心肌组织制作免疫组化病理切片(4 μm厚)，各组蛋白表达采用免疫组化法进行检测，按试剂盒使用说明书操作。图像分析：每张切片随机在显微镜400倍下取5个视野，用彩色病理图像分析系统进行测量平均光密度(OD值)。

1.2.4心肌细胞凋亡检测 在造模型后28 d将动物处死取各组缺血心肌组织，4%多聚甲醛固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋并制成病理切片(4 μm厚)，采用TUNEL法检测，按试剂盒说明书操作。

1.3统计学方法 采用SPSS19.0 统计软件进行方差分析和非参数检验。

2 结 果

2.1益气活血方动员骨髓干细胞对心肌IRI大鼠心肌细胞JAK2蛋白表达的影响 B组在各时间点JAK2蛋白表达与A组比较明显降低(P<0.01)，而与B组比较，在各时间点C、D和E组JAK2蛋白表达明显升高(P<0.01)；与C，D组比较，E组JAK2表达升高，但在7 d时无显著差异，在14 d，28 d明显升高(P<0.05，P<0.01)。F组较E组明显降低，显示益气活血方联合动员骨髓干细胞可以明显提高JAK2蛋白表达，且时间越久作用越明显。见表1，图1。

表1 各组心肌JAK2蛋白表达

与A组比较：1)P<0.01；与B组比较：2)P<0.01；与E组比较：3)P<0.05，4)P<0.01；下表同

图1 7 d、14 d各组心肌JAK2蛋白表达免疫组化观察(DAB，×400)

2.2益气活血方动员骨髓干细胞对心肌IRI大鼠心肌细胞PI3K蛋白表达的影响 B组在各时间点PI3K蛋白表达与A组比较明显降低(P<0.01)。与B组比较，在各时间点C、D和E组PI3K蛋白表达明显升高(P<0.05，P<0.01)；与C，D组比较，E组在各时间点PI3K表达明显升高(P<0.05，P<0.01)。F组较E组明显降低，显示益气活血方联合动员骨髓干细胞可以明显提高PI3K蛋白表达，且随着时间推移提高PI3K蛋白表达作用越明显。见表2，图3。

2.3益气活血方动员骨髓干细胞对心肌IRI大鼠心肌细胞凋亡的影响 28d时结果显示，B组〔(60.87±4.55)%〕与A组比较明显升高〔(29.25±2.96)%，P<0.01〕，且与B组比较，C〔(45.62±2.00)%〕、D〔(42.50±2.00)%〕和E组〔(35.37±1.92)%〕心肌细胞凋亡明显降低(P<0.01)，而与C，D组比较，E组心肌细胞凋亡明显降低(P<0.01，P<0.05)。F组〔(39.12±1.42)%〕较E组心肌细胞凋亡明显升高，显示益气活血方联合动员骨髓干细胞可以明显减低心肌细胞凋亡作用。见图4。

表2 各组心肌PI3K蛋白表达

图2 28 d各组心肌JAK2蛋白表达免疫组化观察(DAB，×400)

图3 各组心肌PI3K蛋白表达免疫组化观察(DAB，×400)

图4 28 d各组心肌细胞凋亡观察(TUNEL,×400)

3 讨 论

干细胞动员剂可显著增高外周血干细胞水平进而促进骨髓干细胞向缺血组织归巢，在心肌微环境作用下分化为心肌细胞，改善因缺血缺氧环境诱导的细胞凋亡和有效收缩单位减少〔5〕。研究表明，活化的PI3K能使下游信号蛋白丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)发生磷酸化，进而介导细胞的增殖、迁移、分化和存活〔6〕，同时PI3K/Akt信号通路在胚胎干细胞向心肌细胞分化方面起着重要作用〔7〕，具有抗凋亡、促细胞存活等功能。JAK是一类非受体酪氨酸激酶家族，JAK的底物为信号转导子和转录激活子(STAT)，STAT可被JAK磷酸化后发生二聚化，发挥生物学效应〔8〕。研究表明JAK/STAT途径对心肌IRI起着重要作用〔9，10〕，Hwang等〔11〕研究醛糖还原酶过量表达，可以激活JAK/STAT途径，减轻心肌缺血再灌注损伤，而刘胜中等〔12〕则发现JAK2/STAT3信号途径可以减轻细胞凋亡从而保护心肌。促红细胞生成素(EPO)可以抗凋亡、抗炎，促进心肌细胞增殖，促进微血管生成〔13〕，同时EPO显著增强血管内皮祖细胞的动员〔14〕。Kilic等〔15〕研究发现EPO可以激活Jak/Stat，PI3k/Akt信号途径，进而发挥抗氧化、抗凋亡作用，保护缺血心肌。

中医学认为，心肌IRI其病位在心，涉及血脉，辨证多属气虚血瘀，本虚标实。益气活血方是由丹参饮加味而来，应用中医“气行则血行”的理论，用黄芪补气培元，扶助心气；重用丹参活血化瘀入血分；檀香善入气分；生地黄、当归补虚养血治本。全方补气活血，通络止痛。我们前期研究〔16，17〕表明益气活血方可以提高CD34+蛋白表达，促进骨髓干细胞动员，同时可以升高Bax蛋白表达。本研究结果显示，且益气活血方可以显著动员自身骨髓干细胞，从而增加血液中干细胞数量，然后促进干细胞归巢和提高干细胞定向分化数量并激活JAK2/STAT3和PI3/AKT信号途径，进一步通过激活或抑制其下游靶蛋白，减少细胞凋亡。

综上所述，益气活血方与动员骨髓干细胞相结合治疗心肌IRI具有协同增效、优势互补作用，其机制之一可能是益气活血方直接抑制心肌细胞凋亡或动员骨髓干细胞，影响其归巢，促进干细胞定向分化，与调节JAK2-PI3K信号转导，从而有抑制心肌细胞凋亡有关。