刘小燕 陈文江 王 江

(第三军医大学第二附属医院新桥医院心血管内科，重庆 400037)

心力衰竭(HF)是临床常见各种心脏疾病的终末期综合征，随着我国人口的老龄化进程，HF的发病率呈逐年增加的趋势，据我国最新心血管病调查报告显示：我国人群慢性心力衰竭患病率为 0.9%(其中男性 0.7%，女性 1.0%)；其患病率随着年龄增加而显著上升；我国北方人群发病率高于南方人群(1.4% vs 0.5%)，且城市人群发病率高于农村人群(1.1% vs 0.8%)〔1〕。HF的主要病因已经从风湿性瓣膜性心脏病转变成冠状动脉粥样硬化性心脏病，而且高血压、糖尿病、心房颤动等都是导致HF的病因。近10余年来，HF的病理生理机制得到进一步研究，同时新的治疗方法被发现，尤其是干细胞治疗、免疫调节治疗、基因治疗等，为未来HF的治疗展现了新希望。近年来，不断有研究发现在HF的发生发展中有复杂的微小RNA(miRNA)异常表达，提示miRNA可能参与HF的发生发展〔2～5〕。国外研究表明，miRNA-423-5p与HF的发生发展有关，但其研究结果仍存在一定争议〔6〕，主要可能是与种族、研究样本等的限制有关。因此，进一步研究miRNA-423-5p与HF的发病的关系显得尤为重要，以达到早诊断、早预防、早治疗HF的目的。本研究拟从中国人群进行miRNA-423-5p与HF的发病关系的研究。

1 对象与方法

1.1研究对象 选择2015年3～9月新桥医院入院的HF患者40例，另外纳入40例年龄、性别等方面匹配的非HF患者。HF患者按照《中国心力衰竭诊断和治疗指南2014》〔7〕进行诊断和分级，HF组均为纽约心脏病学会(NYHA)Ⅲ和Ⅳ级。两组人群在年龄、性别和基本病史方面差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。于患者入院24 h内抽取患者2 ml静脉血，并分离血浆(3 000 r/min，24℃，10 min)，保存于-80℃冰箱，以备后续实验用，并收集患者基本病史和生化检测指标。

1.2miRNA 实时荧光定量检测 按照说明书用Trizol试剂(Invitrogen，美国)提取所获取患者血浆的总RNA，然后按照miRNA逆转录试剂盒(Mir-XTMmiRNA First Strand Synthesis Kit，宝生物工程大连有限公司)说明书对所提取总RNA进行miRNA的逆转录，然后按照实时荧光定量PCR试剂盒(宝生物工程大连有限公司)说明书进行实时荧光定量：95℃预变性30 s；95℃扩增、延伸15 s；60℃退火30 s，共40个循环，以U6作为内参，miRNA-423-5p(UGAGGGGCAGAGAGC GAGACUUU)和U6引物由宝生物工程大连有限公司设计合成，而其下游引物为试剂盒配备通用引物。本研究采用2-ΔCt相对定量方法对数据进行分析：ΔCt(实验组)=Ct(实验组目标基因)-Ct(实验组内参基因)；ΔCt(对照组)=Ct(对照组目标基因)-Ct(对照组内参)。

表1 两组入选人群基本信息(n，n=40)

1.3miRNA-423-5p生物信息学预测 采用生物信息学软件miRBase〔7，8〕(http：//mirbase.org/)了解miRNA-423-5p的生物学功能，并采用其提供的生物信息学预测软件MIRDB、MICRORNA、RNA22、TARGETSCAN〔9～13〕对miRNA-423-5p的靶基因和KEGG (京都基因与基因组百科全书)信号通路等，探讨其生物功能和可能致病机制。

1.4酶联免疫吸附试验(ELISA) 由武汉博士德生物工程有限公司提供试剂盒(产品号：EK0469)对患者血浆中神经生长因子(NGF)-β进行检测，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。

1.5统计学方法 采用GraphPad Prism5进行χ2检验或Fisher检验及t检验。

2 结 果

2.1血浆中循环miRNA-423-5p 实时荧光定量结果 HF组miRNA-423-5p的表达水平(0.074 42±0.009 391)明显高于非HF组(0.021 14±0.005 048，P<0.000 1)，提示miRNA-423-5p可能与HF的发生有关。

2.2miRNA-423-5p的受试者工作特征(ROC)曲线分析 miRNA-423-5p的ROC曲线下面积(AUC)为0.852 8，其95%CI为0.769 1～0.936 5，P<0.000 1，见图1，提示血浆循环miRNA-423-5p可以作为HF患者的生物标志物。

2.3miRNA-423-5p生物信息学分析 通过MIRDB、MICRORNA、RNA22、TARGETSCAN等在线生物信息

学软件预测发现，miRNA-423-5p的靶基因主要有：NRSN2(Neurensin-2)、NGF、MAPK1、PIK3CA、IGF1、PRKACA、CPLX2、IMPDH1、KLK4、EVC、C20orf27、TSPAN11、WNT3A、FOXP4、SCN4A、NAT8L、SCAF1、CEND1、MAPKBP1、DDX54、NACC1；其KEGG信号通路主要有Neurotrophin信号通路、Wnt信号通路、醛固酶调控的钠的重吸收、胰岛素信号通路等，见表2，从其预测结果可推测：miRNA-423-5的生物学功能可能主要与调控心脏NGF、Neurensin-2、神经营养因子信号通路、胰岛素受体信号通路和Wnt通路等有关，有可能主要是影响HF后的神经重构。NGF属于对神经元的生长、分化、延长存活期具有促进作用的生长因子家族，该家族主要包括NGF(主要包括NGF-β，2.5S NGF，7.5S NGF)、BDNF、NT-3、NT-4等，因此，我们选择NGF-β作为候选靶基因进行后续实验。

图1 血浆循环miRNA-423-5p 的ROC曲线

ID号名称靶基因P值Bonferroni校正后P值hsa04910胰岛素信号通路KRAS,MAPK1,PIK3CA,PIK3R3,PPP1R3C,PRKAA1,PRKAA2,PRKACB,PRKX,RAF1,SOCS1,SOCS3,SOS2,TSC10.006 2090.033 248 2hsa04710昼夜节律CLOCK,CRY1,FBXW11,NPAS2,PRKAA1,PRKAA2,RORA0.000 454 720.075 028 8hsa05414扩张型心肌病ADCY9,ADRB1,DAG1,IGF1,ITGA2,ITGA6,ITGB8,PRKACB,PRKX,TNF0.0115 7290.049 258 9hsa04310Wnt信号通路BAMBI,CCND1,CCND2,DAAM1,FBXW11,FOSL1,FZD6,NLK,PLCB1,PPARD,PRICKLE2,PRKACB,PRKX,SMAD4,WNT10A,WNT30.001 478 310.243 922hsa04722神经营养因子信号通路CRK,PIK3R20.004 270 660.051 247 9hsa04960醛固酮调控的钠重吸收IGF1,KRAS,MAPK1,NR3C2,PIK3CA,PIK3R3,SGK10.002 355 660.388 684

2.4两组血浆NGF-β 表达比较 HF组血浆NGF-β表达〔(301.2±10.31)pg/ml〕明显高于非HF组〔(91.56±8.477)pg/ml，P<0.000 1〕，说明NGF-β可能参与了HF后心脏的神经重构，也可能为miRNA-423-5p的靶基因。

3 讨 论

HF的治疗需要不断的探索和创新，因此，对HF新发病机制的认识将为HF的治疗提供新途径和方法。miRNA是一类小非编码RNA，本身不具有编码作用却可以调控基因的表达。近年研究证实血液、尿液等体液中有miRNA存在，称之为循环miRNA(cmiRNA)〔14～16〕。cmiRNA通过微小囊泡、与RNA结合蛋白结合和与高密度脂蛋白颗粒结合形成复合物而被分泌出来。cmiRNA不依赖于细胞而存在于体液中，而其在体液中的表达与它们在细胞中表达水平有一定相关性，并且能够被受体细胞摄取而调节靶基因的表达〔17，18〕。近年来对于这一不依赖于细胞而存在的cmiRNA的研究较多，在心血管疾病主要是在急性心肌梗死方面取得一定成果，最近有研究者提出cmiRNA可能是疾病诊断中一种新的、非侵入性的生物标志物〔19～21〕。cmiRNA在临床应用的优势主要由于其便于获取、易于研究，因此cmiRNA与心血管疾病的研究具有一定前景。本研究提示在HF患者血浆中循环miRNA-423-5p可以作为HF发生新的生物标志物，为HF临床的诊治提供了新的途径和方法；且miRNA-423-5p有可能主要是通过NGF及其信号通路等影响HF后的神经重构；NGF-β可能参与HF的发生，并可能为miRNA-423-5p的靶基因。由于miRNA调控基因的多样性和复杂性及本研究所用研究人群较小，因此，关于循环miRNA-423-5p与HF发病机制的研究还有待进一步研究，关于NGF-β与心衰的具体机制和其与miRNA-423-5p是否互为调控或者为其靶基因，还有待后续相关实验进行验证。