范东旭，刘彦东*，薛金枝，王瀚锐，程明勋，金 松

（1.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154007；2.大庆市第四医院，黑龙江 大庆 163712）

随着糖尿病患者在血管外科患者中所占比例逐渐增加，引起血管外科医生高度重视，对糖尿病患者血管再生的研究成为热点，相关研究证明，Notch信号通路能促进非糖尿病动物缺血区的血管新生、动静脉分化等，本课题应用不同浓度的γ-分泌酶抑制剂（DAPT）对Notch信号通路的关键酶γ-分泌酶进行抑制，探寻适宜血管再生的浓度，为进一步研究DM下肢缺血区血管新生提供实验理论依据。

1 材料与试剂

1.1 组织来源

已完成鉴定冻存的糖尿病大鼠血管平滑肌细胞。

1.2 试剂

0.25%胰酶细胞消化液 invitrogen 公司，TRYPSIN 0.25%EDTA（25200056 Life），D-PBS （sh30028.01B Hyclone），D-Hank’s液（不含Ca、Mg）（sh30030.03B Hyclone），γ-分泌酶抑制剂（DAPT）（美国Sigma公司），细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（MTT BB-4201贝博生物）。

1.3 培养基

在DMEM培养液（Gibco BRL，USA）培养基中添加15%胎牛血清（南美）（sv30087.02 Hyclone）、1%青霉素、1%链霉素，200目筛，一次性过滤除菌器除菌备用（4周内用完）。

1.4 器械及仪器

T25培养瓶，倒置显微镜，细胞计数板、超净工作台，96孔细胞培养板Corning Inc等。

2 方 法

2.1 细胞复苏及传代[1-2]

从液氮罐中取冷冻管，迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，使其1 min内完全融化，

然后在超净工作台中打开冻存管，用吸管将细胞悬液注入离心管中，滴加10ml 培养液；

然后1000 r/min离心5 min，弃上清，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1*10g/L，置37℃ 5%CO2培养箱中培养，次日更换养液，继续培养，观察生长情况，若细胞在80%～90%融合时即可细胞传代，以后根据情况在长满1～2天后开始传代；所有操作均在超净工作台中进行，将细胞悬液按1：2传代培养，加入培养基悬浮细胞后，置37℃、5%C02培养箱中培养，每3 d换培养液一次，传代至第3代时可进行MTT实验。……