陈艳慧 俞凤 边泽源 洪建明 钟桥石 杭亚平 张楠 胡龙华

(1.南昌大学第二附属医院检验科 江西医学检验重点实验室；2.江西省胸科医院；3.南昌市第九医院，南昌 330006)

新生隐球菌是一类担子菌类的酵母菌，能引起免疫功能不全患者和健康人较高的发病率和死亡率。据估计，全球每年约有960 000例HIV相关的隐球菌病[1]。令人可怕的是，在一些抗病毒和抗真菌治疗条件有限的地区，大约60%的HIV患者在感染隐球菌后立即死亡[1]；如果没有使用特定的抗真菌药物治疗，则入住医疗机构治疗2周内的死亡率达100%[2]。随着HIV的流行，HIV相关性隐球菌病的发病率和死亡率逐渐增加，尤其在南非和东南亚地区[3]。先前研究显示，在我国，HIV相关隐球菌病发病率仅为12.9%～24.7%[4]，近两年有研究表明四川和江西地区HIV相关隐球菌病发病率均大于40.0%[5-6],高于全国统计水平。然而，我国对HIV患者新生隐球菌感染的分子流行病学研究较少，故收集本地区34株分离自HIV患者的新生隐球菌，分析其耐药性、毒力表型、基因型、交配型、血清型及ST型，旨在为HIV患者新生隐球菌感染的预防和治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

收集江西省多家医院2016年1月～2017年12月HIV患者首次分离的新生隐球菌34株。所有菌株均经VITEK MS质谱仪 (法国梅里埃)和特异性引物SOD1进行鉴定，同时对患者资料进行回顾性调查。标准菌株：WM148 (serotype A, VNI)。

1.2 药敏实验和毒力表型检测

采用ATB Fungus 3 (法国梅里埃)测定34株新生隐球菌对常用抗真菌药物氟康唑 (FCA)、5-氟胞嘧啶 (5FC)、伊曲康唑 (ITR)、伏立康唑 (VRC)和两性霉素B (AMB)的敏感性。判读标准参照2008版CLSI文件。CandidaparapsilosisATCC22019和CandidakruseiATCC6258作质量控制。用印度墨汁染色观察荚膜厚度，尿素酶实验和37℃生长实验检测新生隐球菌的毒力表型特征。

1.3 DNA提取

参照Alessandro等[7]的快速DNA提取方法进行操作。4℃保存抽提出的DNA。

1.4 血清型和交配型确定

参考Yan等[8]的方法，采用血清型和交配型特异性引物 (STE20Aa、STE20Aα、STE20Da和STE20Dα)进行PCR特异性扩增。标准菌株：H99 (serotype A, MATα), JEC21 (serotype D, MATα)和JEC20 (serotype D, MATa)。引物序列和反应条件见表1。

1.5 MLST分型

根据国际人类和动物真菌学会 (ISHAM)的共识方案[9]，对新生隐球菌的7个管家基因CAP59、GDP1、LAC1、PLB1、URA5、IGS1、SOD1进行PCR扩增。扩增产物测序后，将所有测序结果提交至NCBI。

(National Center for Biotechnology Information)数据库获得GenBank登录号并通过新生隐球菌/格特隐球菌复合群数据库 (http://mlst.mycologylab.com)确定每株菌的序列型 (sequence type, ST)。引物序列和反应条件见表1。

1.6 PCR扩增及电泳

采用25 μL PCR反应体系：上下游引物 (10 μmol/L)各1 μL,模板1 μL, 2xTaq PCR Mastermix 12.5 μL, ddH2O 9.5 μL。以DL2000 TM DNA Marker作为参照，吸取4 μL PCR产物加样在1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳，电压100 V,时间50 min。

2 结 果

2.1 患者资料

34株新生隐球菌为2016年1月～2017年12月从江西省多家医院HIV患者中分离，男性多于女性，比例为2.4∶1；年龄分布范围为22～69岁 (中位年龄为38.7岁)，见表2。大部分患者以头痛、呕吐、发热、脑膜刺激征等中枢神经系统症状就诊，少部分患者有不同程度视力下降、视物模糊或意识障碍。患者入院初次脑脊液压力平均为 (27.26±11.52) mmH2O，CD4细胞计数中位数28 cells/μL (3～163 cells/μL )，脑脊液白细胞中位计数32 (2～110)×106/L，蛋白质定量中位数为362 mg/L (160～2 730 mg/L)，葡萄糖含量中位数为2.28 mmol/L (1.50～5.98 mmol/L)。

2.2 菌株分布、毒力表型及药敏结果

表1 PCR引物序列和反应条件

本次分析的34株新生隐球菌中，首次分离自脑脊液的占大部分 (n=25, 73.5%)，余下的首次分离于血液 (n=9, 26.5%)，见表2，其中脑脊液和血液都培养出新生隐球菌仅占14.7%。所有菌株在37℃温箱培养24 h后均可见菌落生长；在尿素琼脂培养基培养24 h后，均呈红色；经墨汁染色后在镜下观察，均可见隐球菌荚膜清晰及芽生孢子结构。所有菌株对5种常用抗真菌药物氟康唑、5-氟胞嘧啶、伊曲康唑、伏立康唑和两性霉素B都敏感，见表2。

2.3 血清型、交配型、基因型和ST型

所有新生隐球菌血清型均为A型，交配型为α，基因型为VNⅠ。MLST分析共检出3种ST型，包括ST5 (n=32)、ST32 (n=1)和ST186 (n=1)。CN30 (ST32)来自江西上饶，CN90 (ST186)来自于江西鹰潭，ST5在江西省各个地区均有发现，见表2。

3 讨 论

在HIV流行的时代，尽管进行积极抗逆转录病毒的治疗，但是新生隐球菌仍是威胁艾滋病患者生命的严重机会致病菌，是南非地区导致感染性疾病死亡的第四大元凶[10]。根据最近的分类研究，隐球菌病主要由新生隐球菌和格特隐球菌引起，新生隐球菌包括3个血清型 (A,D,和AD)和4个基因型 (VNⅠ,VNB/VNⅡ,VNⅢ和VNⅣ)，且主要引起艾滋病患者感染；格特隐球菌包括2个血清型 (B和C)和4个基因型 (VGⅠ,VGⅡ,VGⅢ和VGⅣ),且地理分布局限，主要分离自免疫正常个体。在HIV合并隐球菌感染的人群当中，除了积极抗病毒治疗还应长期抗真菌治疗，而长时间的抗真菌治疗将导致耐药的产生。因此，了解新生隐球菌的流行病学、种群构成、进化，将有助于提高临床医生预防和治疗新生隐球菌感染的能力。

表2 34株新生隐球菌的信息和药敏结果

34例HIV患者中，男性患者是女性的2.4倍，且中位年龄为38.7岁，与非洲的女性多于男性，中位年龄为35岁稍有不同[11]。和大多数研究一样，新生隐球菌主要侵犯HIV患者的中枢神经系统。本次研究的大部分患者有头痛、恶心、呕吐、发热、脑膜刺激征阳性等中枢神经系统症状，少部分患者有不同程度视力下降、视物模糊或意识障碍。其中不同ST型菌株 (ST5，ST32，ST186)感染的患者临床表现无明显差异。HIV患者免疫水平低下，起病隐匿，进展缓慢，有研究显示CD4细胞计数<20 cells/μL是患者死亡的风险因素 (OR=18.0，P=0.037)[12]。患者颅内压明显升高，且在诱导治疗期间可进一步升高，有研究报道[13]，颅内压的变化对脑脊液的抗菌药物浓度无影响，但降颅内压也是治疗的关键。我们的结果显示脑脊液白细胞升高不明显，脑脊液蛋白水平较高，与Boulware等[14]和Abhilash等[13]的研究结果不一致，且初始脑脊液白细胞≤25 cells/μL,蛋白≤50 g/L与免疫重建炎症反应综合征 (immune reconstitution inflammatory syndrome，IRIS)的发展有关[14]。 脑脊液葡萄糖低于正常值。

表2显示34株新生隐球菌中，大部分 (73.5%)首次分离自脑脊液，首次分离于血液仅占 (26.5%)，且查阅患者临床病历发现脑脊液和血液都培养出新生隐球菌仅占14.7%，表明新生隐球菌主要引起HIV患者中枢神经系统感染，同时也能够血行散播，并且在同时送脑脊液和血培养情况下，脑脊液报阳性时间更早，原因可能是脑脊液中菌量更多。墨汁染色镜检显示，所有菌株可见完整较厚荚膜，可以帮助菌体逃避宿主免疫细胞的吞噬；37℃生长良好，尿素酶实验阳性，未发现表型变异株。药敏结果显示，所有菌株对5种抗真菌药物都敏感，即是如此，仍有部分菌株对有些抗菌药物表现出较高的MIC，提示我们应密切关注其耐药性变迁，进一步分析发现，当前提倡的两性霉素B联合氟胞嘧啶标准初始治疗仍较适合。本研究未发现抗真菌药的MIC值与地理区域或菌株的ST型之间存在关系。

本次研究的所有新生隐球菌表现出相同的血清型A，交配型α和基因型VNⅠ，同时也是全球主要的新生隐球菌家族[15]。Feng等[16]的研究表明血清型A，交配型α和基因型VNⅠ同样是非HIV感染患者新生隐球菌的主要血统。研究结果表明，我国HIV患者和非HIV患者分离的隐球菌的亚种无差异。和巴西研究感染HIV患者新生隐球菌的基因多样性不同[17]，本次研究仅检出3个ST型，绝大多数为ST5，ST32和ST186各1株。ST5普遍存在东亚国家，包括中国、日本、韩国，且感染免疫缺陷和免疫功能正常者之间无差异[18-20]。可能是ST5相对其他型更具有毒性，也可能是ST5起源于东亚且逐渐适应了环境。到目前为止，ST186在地理位置上是独一无二的，仅在上海被发现；ST32在日本，越南和泰国仅有个别案例报道，此次研究为中国首次发现。由于ST32患者临床资料有限，我们无法确定感染源，感染获得可能通过移民或旅游，也可能通过候鸟传播。

综上所述，我们的研究揭示了HIV合并新生隐球菌感染的流行病学模式和临床特征。本次研究提示近两年江西省HIV合并新生隐球菌感染主要以中年男性多见，实验室脑脊液检查缺乏特异性。首次分离的菌株对临床常用抗真菌药物较敏感，后期我们将监测抗真菌药治疗后菌株的药敏情况。研究发现ST类型较单一，ST5是HIV患者新生隐球菌感染的主要序列类型，与国外研究发现基因多样性不同，这可能与本次研究样本量小，地区来源单一，时间跨度小存在一定关系。